Notch受體家族與心肌重構的研究進展

袁雨培綜述 唐其柱審校

據《中國心血管病報告2018》報道，我國心血管疾病現患人數2.9億，其中高血壓病2.45億例，心力衰竭450萬例[1]。心力衰竭是高血壓、冠心病、心肌病等多種心血管疾病的最終結局，盡管目前臨床藥物和器械輔助治療可延緩心力衰竭進程，心力衰竭患者的總體預后仍很差。心肌重構貫穿心臟損傷的始終，是心血管疾病進展為心力衰竭必然經歷的病理生理過程。心肌重構是指心臟在損傷或血液動力學異常時，從基因到結構的重建，最終導致心臟大小、形狀和功能發生改變。心肌重構過程中，間質發生纖維化，降低心臟順應性，影響心臟的舒張功能；心肌細胞凋亡，數目減少，影響心臟的收縮功能。膠原纖維包裹心肌細胞導致電傳導障礙引發惡性心律失常；心肌細胞肥大導致血管密度相對降低，引發心肌缺氧。因此，需要深入研究心肌重構的分子調控機制，以發現心肌重構和心力衰竭治療的新靶點。

對于心肌重構雖已進行了大量的研究，但其具體發生機制仍不十分明確，心肌細胞及其他非心肌細胞(成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等)的凋亡或增殖，心肌的炎性反應、氧化應激反應，纖維化及心肌內血管生成等均被證明參與了心肌重構發生發展[2-4]。而近期研究發現，Notch家族蛋白可參與調節上述多種過程，可能對心肌重構發揮作用[5-6]。因此筆者結合最新研究，對Notch家族蛋白與心肌重構的研究進展進行綜述，以期為進一步探究提供更多理論依據。

1 Notch受體家族概述

Notch受體家族是一種高度保守的膜蛋白受體家族，在哺乳動物中包含4個同源受體，即Notch1～4。Notch最早由Morgan在突變的果蠅中發現，該基因的功能缺失會導致果蠅翅膀邊緣出現缺刻，后研究發現Notch也廣泛表達于脊椎動物、哺乳動物等多個物種中。Notch受體分子量為300 kD左右，由胞外區、跨膜區和胞內區組成。胞外區包含數個表皮生長因子樣重復序列及保守的富含半胱氨酸位點，主要功能是和配體結合，激活Notch信號通路產生效應；胞內區包含1個RAM序列、6個CDC10/錨蛋白樣重復序列、2個核定位信號、1個轉錄激活區及1個PEST序列，主要功能是將Notch信號轉到細胞核內。鄰近細胞的Notch胞外區與配體結合，在腫瘤壞死因子α轉換酶、γ-促分泌酶作用下發生2次蛋白裂解，形成可溶性Notch胞內區活化形式(intracellular domain of Notch，NICD)進入細胞核，與初級轉錄因子CSL結合，啟動下游靶基因的表達。高等動物Notch下游靶基因為Hes和Hey。除了CSL經典通路外，Notch還被證明可以通過非CSL依賴的方式激活，如絲氨酸/絲氨酸特異性蛋白激酶的激活[7]。

目前對Notch信號通路的研究涉及胚胎的發育、免疫系統功能調控、腫瘤的發生、神經退行性變及炎性反應等病理生理過程。心血管方面，Notch的表達可在胚胎期心臟檢測到。其中Notch1主要表達于心臟的流出道、房室管、室壁小梁及心外膜，Notch2主要表達于房室管、肺動脈及主動脈，Notch3主要表達于肺動脈和主動脈，Notch4主要表達于主動脈內皮。Notch1～3均在胚胎第11天開始有表達，12周期間達到峰值，Notch4起始表達量低，2周時達到高峰。Notch家族受體的表達參與調控心臟各部位的形成，在心臟發育中發揮重要的作用；其信號的缺失會導致各種先天性心臟病的發生[5]。Notch受體家族在心臟發育中的作用已得到廣泛探究，但在成人心臟中的作用研究尚未完全明確。

2 Notch受體家族與心肌重構

現有研究顯示，在導致心肌重構的不同疾病模型中，Notch受體家族各成員均參與了各種心肌重構的發生過程，發揮不同的作用。

2.1 Notch1受體與心肌重構 心肌重構是在炎性反應、氧化應激或機械應力等刺激下，心肌細胞及其他非心肌細胞發生凋亡。而抑制各種刺激因素，減緩細胞凋亡的發生可有效地抑制心肌重構的進展。Rocca等[8]研究顯示，缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)會導致大鼠心肌損傷，心功能惡化；但激活Notch1后梗死面積減小，大鼠心功能明顯好轉。體外實驗顯示，Notch1過表達可降低心肌細胞凋亡率，即Notch1的心肌重構保護作用可能是通過抑制細胞凋亡發揮的。同樣地，Du等[9]研究顯示，小鼠心肌梗死(myocardial infarction, MI)模型組相對于對照組，Notch1及其活性成分N1ICD的轉錄及表達水平增加。而使用Notch1的激活劑后，心臟中丙二醛及一氧化氮合酶的含量明顯降低，凋亡陽性細胞數目及Caspase3的表達水平降低，即心肌中氧化應激反應及凋亡水平降低；心肌損傷標志物水平下降，心功能好轉。由此證明激活Notch1可通過抑制心臟內氧化應激水平并進一步減少細胞凋亡發揮保護作用。而抑制Notch1后，上述保護作用消失，氧化應激反應及凋亡程度上升。Yang等[10]發現激活Notch1可通過抑制炎性反應的發生保護心肌，具體表現為Notch1可減少因MI導致的炎性因子如白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、單核細胞趨化蛋白-1和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的轉錄及表達增加，減少心肌內巨噬細胞浸潤，進一步抑制細胞凋亡，恢復心功能。

Notch1還被證明可通過抑制心肌重構的關鍵過程——心肌纖維化來調控心肌重構的發展。在轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)刺激的成纖維細胞中，過表達Notch1后可觀察到成纖維細胞的增殖被明顯抑制，成纖維標志物Ⅰ型膠原表達減少，且進一步機制探究顯示Notch1的這一作用是通過抑制纖維化相關通路TGF-β1/Smad發揮的[11]。在大鼠MI模型中，Notch1也被證實可與TGF-β1/Smad3通路相互拮抗，Notch1抑制TGF-β1及Smad3的激活，抑制纖維化標志物的產生，減少成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，MI大鼠心肌纖維化減少，減輕心肌重構的發生[12]。另外，在阿霉素(doxorubicin，DOX)導致的斑馬魚心臟損傷模型中，Notch1也被發現可以減少DOX導致的心肌纖維化，主要是通過抑制纖維連接蛋白(fibronectin，FN)、TGF-β1以及結締組織生長因子的表達，并可進一步減少細胞凋亡[13]。

最新研究顯示，Notch1還與心臟中血管的生成密切相關。Liu等[14]發現Notch1可增強MI模型大鼠的心功能，具體表現為側支循環血流量及心肌灌注增加，缺血心肌的體積減小；進一步對血管密度進行檢測發現，Notch1激活增加了微循環的血管數量及大小。Zhao等[15]研究表明，Notch1可促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及堿性成纖維細胞生長因子表達，進一步促進新生血管成熟，增加缺血心肌的局部血流，說明Notch1可通過調控心臟內血管的生成及成熟對抗心肌重構的發生。Notch1還被證明與內質網應激有關，Zhang等[16]發現在I/R小鼠心肌重構模型中，過表達Notch1可抑制內質網應激關鍵酶蛋白，如激酶R樣內質網激酶、α亞基的真核起始因子2及C/EBP同源蛋白的激活或表達，進一步減少細胞凋亡，緩解心肌重構的發生，改善心功能。

另外，間充質干細胞(mesenchymal cells，MSC)的激活、增殖和遷移對于心臟損傷的修復有重要作用；且有研究顯示，心力衰竭患者的脂肪間充質干細胞中Notch1表達明顯下調[17]。而最新研究顯示，MI模型小鼠中，Notch1可通過介導血清外顯體的表達，促進內源性間充質干細胞的激活，促進VEGF的表達及血管生成，有助于心臟損傷修復[18]。

2.2 Notch2受體與心肌重構 現已有大量研究證明，Notch2在心臟發育中的作用至關重要，它參與心肌細胞的增殖、分化和凋亡等過程，敲除Notch2可能會導致心肌肥厚、致密化減少和室間隔缺損等問題[19-21]。但其在成熟心臟中的作用研究較少。Richard等[22]研究顯示，小鼠I/R損傷后，心臟中Notch2轉錄水平相對于假手術組明顯下降；外源性給予二十二碳六烯酸激活Notch2后，心肌梗死面積減小，氧化應激水平降低，心臟耗氧量、ATP消耗及肌酸激酶的釋放均減少，即Notch2的表達可通過調控氧化應激發揮心臟保護作用。另外，在豬慢性缺血心臟損傷模型中，高脂飼料喂養組相對于正常飼料組Notch2的表達下降，細胞凋亡增加，免疫熒光顯示Notch2的表達高度集中于平滑肌壁，與平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)共定位。但與對照組相比，心臟毛細血管密度無明顯差異，說明Notch2的促血管生成功能還有待進一步探究[23]。另有研究顯示，Notch2的激活不僅可以調節血管平滑肌細胞的增殖與凋亡，還可促進血管內皮細胞生成細胞球蛋白，加強平滑肌細胞對一氧化氮的利用，進一步促進血管功能；Notch2也可能通過對血管內皮細胞及平滑肌細胞的調節發揮心肌重構抑制作用[24-25]。除了發揮保護作用，Notch2的表達還被證明可促進心肌纖維化的發生。Geng等[26]研究顯示，在高糖刺激的人主動脈瓣內皮細胞中，相對于對照組細胞，Notch2的表達明顯上調，內皮間質轉化增加，纖維化標志物如α-SMA、FN和波形蛋白等表達增加；而給予microRNA-18a-5p抑制Notch2的表達后，內皮間質轉化減少，纖維化標志物減少。在糖尿病心肌病大鼠模型中，Notch2的表達抑制使內皮間質轉化及心肌纖維化減少，心功能好轉。由此說明，Notch2對于心肌重構的作用可能存在兩面性，具體作用及機制還有待更進一步探究。

2.3 Notch3受體與心肌重構 在離體大鼠心肌細胞中，Notch3被證明是Notch受體家族的主要表達受體，且在慢性心力衰竭模型中，Notch3的轉錄水平升高，且表達水平升高更為顯著[27]。Zhang等[28]研究發現，小鼠I/R損傷模型中，Notch3可被腫瘤抑制素M激活，Notch3表達增加可減輕I/R造成的損傷，具體表現為Notch3激活組小鼠心肌損傷標志物乳酸脫氫酶和肌酸激酶同工酶明顯降低，心肌梗死面積減小，心臟射血分數增加，心臟中ROS水平及線粒體中錳超氧化物歧化酶活性降低，心肌細胞凋亡減少。更為重要的是，Notch3減輕了I/R導致的小鼠線粒體結構紊亂，增加了其生物合成，主要通過提高小鼠缺血心肌線粒體ATP含量，增強檸檬酸合酶活性及呼吸鏈復合體Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ的活性。細胞實驗進一步驗證了Notch3的上述作用，證明Notch3過表達可明顯緩解心肌重構，相反地，抑制其表達會加重心肌重構。進一步研究發現，Notch3的這一心臟保護作用是由PI3K/AKT通路介導的。另有研究顯示，Notch3可被apelin干預激活，進一步促進骨髓細胞的招募，抑制MI導致的小鼠心肌活性氧的生成增加及心肌細胞凋亡，增強心功能[29]。

Notch3還與心肌纖維化密切相關。在小鼠心肌梗死24 h后，Notch3表達迅速增加。與單純MI小鼠相比，過表達Notch3的小鼠心功能好轉，存活率升高，而沉默Notch3的小鼠心功能惡化，存活率降低。過表達Notch3可明顯抑制心臟內纖維化標志物α-SMA、Ⅰ型膠原、金屬蛋白酶組織抑制劑-2的轉錄和表達；且Notch3激活后p-Smad3表達降低。體外實驗中，過表達Notch3可抑制TGF-β1誘導的心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，同時也驗證了這一作用是通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路實現的[30]。施建麗[31]研究也顯示，Notch3可抑制心臟成纖維細胞增殖及向肌成纖維細胞轉化，提示Notch3是通過抑制RhoA/ROCK/Hif1α軸發揮對抗心肌纖維化并改善心功能的。

另外，研究還發現Notch3與心臟血管生成密切相關。Ragot等[32]發現Notch3敲除的小鼠在基礎水平即表現出心肌肥厚和纖維化，加入血管緊張素2干預后，出現明顯的心力衰竭：心臟擴張，左心室短軸縮短率降低，心臟損傷標志物表達升高。導致這一結果的原因是，Notch3的敲除使心肌細胞及血管平滑肌細胞凋亡增加，纖維狀肌動蛋白水平下降，纖連蛋白增加，同時血管平滑肌細胞從收縮表型向合成表型轉變，血管生成減少。毛細血管稀疏引起心肌細胞的需求和供給不平衡，引起氧化應激、炎性反應和纖維化。具體表現為心肌內活性氧、還原型輔酶氧化酶Ⅱ、巨噬細胞浸潤、纖維化標志物轉錄水平(ColⅠ、ColⅢ、FN)均明顯增加。由此證明，Notch3還可通過調節血管生成對抗心肌重構的發生。另一研究也顯示，小鼠MI模型中，Notch3可影響微血管的功能及成熟。相對于野生型小鼠，敲除Notch3小鼠的周細胞/毛細血管覆蓋率下降，小動脈成熟減少；雖然對心功能無明顯影響，但脈沖多普勒顯示左冠狀動脈舒張期峰值血流速度顯著降低，冠狀動脈血流儲備明顯下降。且Notch3敲除小鼠在結扎左冠狀動脈前降支后，引起心肌梗死面積更大、心功能更差、病死率更高。Notch3促進血管生成的作用是通過增加VEGF及血管生成素-1的表達發揮的，VEGF及Ang-1表達減少影響心肌缺血后小動脈的形成，使Notch3敲除小鼠平滑肌細胞覆蓋不規則，小動脈壁不完全，新生血管發育不成熟；更進一步導致心臟中炎性反應和細胞凋亡的發生[33]。

另外，Xu等[34]發現在缺氧處理的H9C2細胞中，MicroRNA-1過表達可抑制Notch3激活，同時造成細胞凋亡增加，增殖和自噬減少；證明Notch3的激活可促進心肌細胞增殖和自噬，減少凋亡。也有研究顯示，Notch3的缺失會影響內皮細胞與周細胞的通信，導致周細胞容易脫離并遷移到血管周圍間質中分化為成纖維細胞，這一過程導致血管通透性增加，炎性反應增加，心肌纖維化加重[35]，說明Notch3的表達還可能通過對維持周細胞的穩定性發揮對抗心肌重構的作用，但具體機制還有待進一步探究。

2.4 Notch4受體與心肌重構 一項回歸分析顯示，Notch4基因中的T等位基因rs3134942可增加人群患擴張型心肌病的風險[36]。在糖尿病合并心肌梗死的大鼠模型中，肌酸激酶同工酶、心肌肌鈣蛋白T水平升高，梗死面積增加，心肌細胞凋亡增加，同時，Notch1和Notch4的轉錄及表達水平被明顯抑制；在細胞水平激活Notch通路，使Notch1、Notch4表達增加，高糖及缺氧引起的心肌細胞存活率降低和凋亡增加均被明顯抑制[37]。由此證明，Notch4可通過抑制心肌細胞凋亡，對心肌重構發揮一定的保護作用。另外，Notch4還被證明可被其配體DLL4調節，參與內皮細胞與巨噬細胞的浸潤與分化，與心肌內炎性反應的形成密切相關[38]。由此證明，Notch4與血管內皮細胞關系密切，可通過調節其增殖、遷移及凋亡，并參與內皮細胞與其他細胞的相互作用，調節各種刺激下的心肌炎性反應，抑制心肌重構的發生。另外，Elmadhun等[23]研究發現，在已構建代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)的奧薩博豬中構建慢性心肌缺血模型，結果顯示MS會抑制Notch4的表達，增加心肌細胞凋亡；但小動脈計數及毛細血管密度在MS組和對照組間無明顯差異，即Notch4的表達對血管生成無明顯影響。但與上述結果不同，James等[39]證明Notch4與小鼠發育過程中微血管叢的生成關系密切，但并未探究其對成年小鼠血管生成的作用；這可能是由于Notch4在不同階段的作用不同，有待進一步探究。

3 小 結

Notch受體家族作為心臟發育重要的成分，已被證明可通過抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗纖維化、促血管生成等多種方式調控心肌重構的發生。雖大量研究顯示其在抑制心肌重構中的積極作用，但也有研究顯示部分成員在不同疾病模型中發揮促進作用，且發揮作用的具體機制尚不十分清楚。Notch受體家族特異性激動劑或抑制劑的進一步使用仍需要進一步評估。因此深入探究Notch受體家族與心肌重構的關系，探尋相關的分子作用機制，早日發現組織選擇性或靶基因選擇性的Notch激動劑或抑制劑對心血管疾病的防治具有深遠意義。