肝癌肝再生微環境影響肝干細胞惡性轉化肝癌及其異質性的機制*

李瀚旻 高 翔

1.湖北省中醫院肝病研究所 (湖北 武漢，430061) 2.國家中醫藥科研細胞分子生物學三級實驗室 3.國家中醫藥管理局慢性肝病肝腎論治重點研究室 4.中醫肝腎研究及應用湖北省重點實驗室 5.湖北省中醫藥研究院中醫理論傳承創新中心中醫基礎理論研究所

肝癌死亡率在我國已上升為惡性腫瘤的第2位，GLOBOCAN 2018顯示超過36萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡總數的47.2%[1-3]。由于對其確切發病機制還不十分清楚，目前缺乏可靠的防治措施。以前肝癌防治主要著眼于肝癌細胞本身，但近些年來基于肝癌微環境防治肝癌是新的策略[4-9]。肝癌腫瘤異質性導致患者對放療、化療的治療敏感性，手術后復發以及預后的顯著差異已成為亟待解決的科學問題和臨床難題[10]。

1 基于肝癌肝再生微環境防治肝癌的原創性

近些年來研究認識到肝癌微環境在肝癌發生發展、復發轉移過程中的重要作用后，防治肝癌的理念正在發生重大轉變。目前有關肝癌微環境研究較多的是炎癥損傷、免疫調控、血管新生和腸道微生態等。肝癌肝再生微環境的新概念有別于上述肝癌微環境，其學術思想具有顯著原創性[11,12]。肝癌肝再生微環境是指肝癌發生發展、復發轉移存在正常肝再生與異常肝再生失衡機制，正常的肝再生微環境抑制肝癌的發生發展、復發轉移；異常的肝再生微環境促進肝癌的發生發展、復發轉移，當異常的肝再生微環境占主導地位就會形成惡化的肝再生微環境，即肝癌肝再生微環境。肝癌肝再生微環境又可關聯炎癥損傷、免疫調控、血管新生、腸道微生態等微環境，共同影響肝癌的發生發展、復發轉移。

影響肝癌發生發展、復發轉移的異常肝再生微環境(肝癌肝再生微環境)，主要表現為異常表達的肝再生調控因子及其相關受體，紊亂激活或失活的信號通路，失序的組織結構改變等，統稱異常或惡化的肝再生微環境。異常或惡化的肝再生微環境啟動、促進、甚或加速肝癌的發生發展或復發轉移。其科學性主要基于以下幾個科學依據：一是絕大多數原發性肝癌患者存在肝損傷/肝再生失衡導致的肝纖維化、肝硬化的異常肝再生微環境的病理基礎，抗肝纖維化及肝硬化能降低肝癌發生風險及發生率；二是肝癌手術后復發轉移率高于手術后由于病理損傷與再生修復失衡而加重形成的異常肝再生微環境密切相關，各種微創手術的不斷完善有利于降低肝癌的復發轉移；三是惡化的肝再生微環境促進肝癌的發生發展、復發轉移的部分機制(骨髓干細胞轉化肝癌干細胞)已初步明確；四是基于肝癌肝再生微環境的防治新策略，采用整體動態網絡式調控肝再生，改善肝再生微環境的肝癌三級預防方案已至少獲得多個不同級別的循證醫學證據，其部分療效機制獲得一定程度的揭示[13]。

基于肝癌肝再生微環境的肝癌防治策略總體原則是維持或促進正常肝再生機制，避免或改善惡化的肝再生微環境。在消滅肝癌細胞或組織的基礎上，結合維護正常的肝再生機制和改善肝癌的肝再生微環境是防治肝癌的重要策略之一，研究多成分、多靶點、多層次、多途徑、多時限地改善肝再生微環境而延緩、阻止、甚或逆轉肝癌的發生發展、復發轉移的網絡式作用機制，正在或將會成為防治肝癌的重要研究方向之一，形成新的研究熱點，其研究成果將會推進、豐富和完善肝癌的防治模式，該學術思想的潛在影響力至少包括以下三大方面：一是防治肝癌必須做到減少或減輕肝損傷，避免形成惡化的肝再生微環境。一直以來強調手術切除肝癌的療效，但一度忽視了手術切除可能加重形成的異常肝再生微環境，促進了肝癌的復發和轉移的負面效應，基于肝癌肝再生微環境的肝癌防治策略，提倡在切除肝癌的同時盡量減少正常肝組織的損傷。“根治性”手術方案主要優先考慮少數理想切除患者，而對于大多數非理想切除患者，若需采用損傷性方法清除肝癌組織，應盡量減少正常肝組織損傷，以避免加重形成異常肝再生微環境對肝癌復發與轉移的不利影響，更加完善的治療模式將會提高臨床療效。二是在形成異常肝再生微環境不可避免的情況下，調控正常肝再生與異常肝再生失衡，促進正常肝再生完成結構和功能恢復，改善惡化的肝再生微環境，減少或減輕對肝癌發生發展、復發轉移的不良影響，在各種有創治療的前后及時改善肝再生微環境，更加完善肝癌防治新模式。三是注重整體動態精準。“整體”強調多靶點多環節，發揮網絡式調控優勢。“動態”主張全程監控。“精準”是在揭示肝癌肝再生微環境影響肝干細胞惡性轉化肝癌及其異質性機制(介尺度知識)的前提下，整合“精準治療”與“網絡調控”的知識體系，推進基于肝癌肝再生微環境防治肝癌新策略和新方案的深入研究，提高肝癌防治能力和水平，開辟肝再生調控影響肝癌腫瘤異質性的研究領域，引領調控肝再生防治肝癌的研究方向[14]。

2 肝癌肝再生微環境研究進展

近些年來，隨著醫學科技的迅速發展，有關肝癌的發病機制與肝癌微環境的相互關系有諸多新的發現[4,5]。其中肝再生微環境與肝癌的相關機制研究提高了人們對肝癌發生發展、復發轉移機制的認識和防治水平[15]。目前已知肝癌是多因素、多步驟、多基因、多突變的結果，其發病機制雖有多種假說，但確切機制至今尚未明確是其妨礙提高防治水平的關鍵。近年腫瘤干細胞理論備受關注，認為腫瘤可能是正常干細胞在長期自我更新過程中，細胞微環境、致癌劑和遺傳因素相互作用于干細胞，引起生長分化調控途經中某些分子發生遺傳或表觀遺傳學改變，導致表達異常，進而引起細胞過度異常增殖[16,17]。腫瘤不單是一種基因病，而且是一種干細胞病。基因突變作用于干細胞，干細胞突變成為腫瘤干細胞，這是腫瘤發生發展、復發轉移的關鍵。最新研究表明，原發性肝癌可能是肝干細胞在自我更新過程中失控導致未分化或分化不全的結果，肝干細胞的表觀遺傳改變可能是其重要機制之一，而異常肝再生微環境在這一過程中發揮至關重要的作用[18]。肝癌肝再生微環境有別于正常的肝再生微環境，主要表現為異常表達的肝再生調控因子及其相關受體，紊亂激活或失活的信號通路，失序的組織結構改變等，統稱異常的或惡化的肝再生微環境。正常的肝再生微環境延緩、阻止、甚或逆轉肝癌的發生發展或復發轉移，而異常的或惡化的肝再生微環境則啟動、促進、甚或加速肝癌的發生發展或復發轉移[14]。

有研究表明，肝臟炎癥和纖維化所形成的異常肝再生微環境在肝癌發生發展中起重要作用，約80%肝癌發生在慢性病毒性肝炎引起的慢性炎癥和纖維化背景下，肝癌治療和預后也因腫瘤分期和肝功能異常程度不同而復雜化。大多數慢性肝病均以彌漫性慢性炎癥、壞死和纖維化為特點。慢性炎癥和纖維化發生是一個積聚淋巴細胞、巨噬細胞、基質細胞分泌和旁分泌相互作用的動態過程。屬于固有免疫及適應性免疫的炎癥細胞均參與肝損傷和肝再生，肝損傷與肝再生平衡失調決定肝纖維化的發生發展、復發轉移。損傷的肝細胞、Kuff細胞和肝星狀細胞均參與炎癥誘導。基質微環境、基質與浸潤淋巴細胞的相互作用在決定肝臟慢性炎癥性疾病的纖維化的發生發展的同時，亦影響肝癌的發生發展、復發轉移[19]。業已證明，慢性病毒性肝炎患者體內紊亂的肝再生過程產生大量轉化生長因子-β1(TGF-β1)，它是導致肝纖維化異常再生微環境影響肝癌發生發展的關鍵因素。首先，TGF-β/Smads信號傳導通路發生障礙，細胞生長周期紊亂，肝細胞癌變；其次，由于TGF-β的受體在肝癌細胞表達降低，而失去對可能殘留肝癌細胞增殖的抑制作用；再者，由于高濃度TGF-β1的免疫抑制作用和促進體內血管形成作用反而造成有利于肝癌產生或復發的組織微環境[20]。近年來，隨著對干細胞及干細胞小境的存在及其重要性認識的加深，肝再生微環境在卵圓細胞激活增殖分化過程中的調控作用受到了廣泛關注。肝干細胞小境的惡化是其轉化為肝癌干細胞的肝再生微環境，慢性炎癥和損傷后的再生愈合過程失去時序性和調控就可能發生肝癌。惡性轉化的肝細胞可替代再生過程中不典型改變的增生結節，其中存在的肝癌干細胞決定肝癌的發生發展、復發轉移。低氧和炎癥也是刺激可促進肝癌生長的血管增生的主要因素。Toll樣受體4、核轉錄因子-κB等炎癥相關信號可通過產生大量細胞因子、趨化和生長因子、血管和淋巴管增生因子以及改變基質促進肝癌細胞增生和遷移。總之，肝再生微環境紊亂是肝癌發生發展、復發轉移的必要條件之一，探討肝再生微環境對肝癌發生發展、復發轉移影響的相關機制，提出通過改善肝癌的肝再生微環境防治肝癌發生發展、復發轉移的措施與方案，提高肝癌防治能力和水平具有重要意義[21]。

3 肝癌腫瘤異質性的研究進展

腫瘤異質性為“精準醫療”(分子靶向治療)的開發和應用提出了嚴峻的挑戰。肝癌的腫瘤異質性可能更為明顯，表現為治療后出現的第二原發腫瘤、不同克隆性的同步多灶性腫瘤以及表型和遺傳水平的瘤內異質性，為肝癌分子靶向藥物的開發增加了極大的復雜度[22]。

3.1 原發性和復發性肝癌的腫瘤異質性 根治性切除是早期局限性肝癌的重要治療手段，但是約70%的局限性肝癌患者在根治性切除后復發[23]。肝癌復發的發生率一般在切除后的第一年達到高峰，然后下降，但在治療2年后又逐漸上升[24]。既往研究將早期復發(治療后2年內)歸因于殘余腫瘤或肝內微轉移，而晚期復發(治療后2年以上)歸因于再次發生原發腫瘤[25]。有學者使用整合的HBV DNA作為復發性腫瘤的克隆性的決定因素，發現60%的腫瘤是新生的第二原發腫瘤[26]。有學者通過運用DNA倍性、比較基因組雜交和某些微衛星標記的雜合性缺失等標記，已經鑒定出42%～53%的復發或轉移性腫瘤具有不同于原發腫瘤的克隆[27,28]。最近有研究發現，HBV相關HCC患者中30%的復發中位時間為15.6個月，而多中心出現的中位時間約為2年，表明具有不同克隆性的腫瘤有多中心的發生[29]。這種肝癌手術后復發可能與術后加重形成的惡化肝再生微環境密切相關，其機制之一可能是惡化肝再生微環境影響了肝癌的腫瘤異質性。

3.2 肝癌多灶性腫瘤的瘤間異質性 臨床上HCC的多中心發生或原發癌的肝內轉移顯示出顯著腫瘤異質性[30]。已有研究表明HCC存在幾種穩定的分子亞型，明確表現出腫瘤間異質性[31,32]。多發性HCC的多個病灶是由不同的克隆多中心發展而成，或是由一個原發病灶經肝內轉移而成，這兩種機制引起的多發性HCC治療和預后均顯著不同[28,33]。

HCC在細胞形態、遺傳背景和治療干預反應方面具有高度異質性[34,35]，兩個主要的分子簇(增殖和不擴散)在預后信號、途徑激活和腫瘤表型方面有明顯的富集[36]，一個更有侵略性的增殖類亞型在祖細胞的標記中特別富集[37]。這些觀察結果導致了一些關于肝癌細胞來源的假說，這些細胞以肝細胞和肝祖細胞為主要的細胞成分，其惡性轉化可啟動肝癌的發生。有研究者采用基因組學和蛋白質組學方法來調查兩個HBV相關性HCC患者多發腫瘤的克隆性，被認為有肝內轉移的患者不同腫瘤中HBV DNA整合模式、基因組突變、拷貝數變異、染色體結構等均相似，但異質性決定了他們的預后[38,39]。

3.3 肝癌瘤內異質性 腫瘤內的異質性被認為在腫瘤對癌癥治療的耐藥性中起著重要的作用，包括分子靶向藥物[40-42]。HCC的瘤內異質性可能更明顯，影像學通常表現為HCC的“結節內結節”外觀[43,44]。這種特征性的生長模式反映了分化的HCC中的去分化過程，并進一步導致了單個腫瘤內的異質性。最近有研究證實包括HCC在內的多種腫瘤具有瘤內基因組異質性[45-47]與癌癥預后有關，但其機制不清[48-51]。Zheng等[52]也報道HCC在單細胞水平上存在CSCs生物學和轉錄組異質性，不同標記的CSC細胞亞群之間存在異質性，且CSC標記物表達相關基因與HCC預后相關，表明單個細胞轉錄組的多樣性可能反映了其腫瘤生物學特性，在單細胞水平上進行腫瘤內異質性研究更有可能了解腫瘤異質性對HCC發生發展的影響。原發性肝癌可能是由于包括不同基因型和表觀遺傳修飾的細胞，從而表現出獨有的表型異質性，這些腫瘤細胞被稱為肝癌干細胞，多被認為與肝癌發生、病變異構、治療抵抗以及復發和轉移有關。有研究分析了41個小肝癌(直徑小于3 cm)的組織學分化，發現其中14個肝癌(34.1%)的組織學分化為異質[53]。最近又有研究表明，23例患者中，5例(21.7%)在所有檢測因素方面均存在瘤內異質性[54]。這些發現對以往基于表型和分子變化的HCC知識和分類提出了挑戰[55,56]。Tao等[57]通過對單個患者進行全基因組和外顯子組測序，報道了HCC和復發性腫瘤多個區域的突變譜。

4 有待解決的關鍵科學問題

肝再生機制極其復雜，肝癌的異常肝再生微環境又與正常的肝再生機制相互交織，肝癌的腫瘤異質性受多種與其相關的微環境的影響，如何從如此復雜的相互作用機制中明確關鍵的作用環節存在極大的困難，即存在多層次、多尺度屬性和介尺度復雜性問題。利用日益興起和不斷成熟的解決復雜科學問題的方法和技術是解決這一困難的必然對策，如運用“混沌理論”的思想與方法指導網絡式作用機制的研究，探索平衡與不平衡、確定與不確定、正常與異常、邊界尺度與介尺度、局部與整體的統一。近些年來，肝癌腫瘤異質性的臨床研究較多，肝癌肝再生微環境與肝癌腫瘤異質性的機制研究也有很大進展，但其二者之間的相互作用機制缺乏全面深入的了解。

根據肝癌肝再生微環境與肝癌腫瘤異質性的研究進展，我們提出肝癌肝再生微環境具有影響肝干細胞惡性轉化肝癌及其異質性的作用及其機制的科學假說。進一步研究擬解決的關鍵科學問題是肝癌肝再生微環境影響肝癌腫瘤異質性(肝癌肝再生微環境影響肝干細胞惡性轉化肝癌及其異質性)的相關機制。如卵圓細胞是肝再生修復的重要肝干細胞之一，當肝細胞增殖受抑制或肝細胞再生不足以滿足再生修復時，卵圓細胞增殖成為肝再生修復的重要途徑，如此會形成惡化的肝再生微環境。但卵圓細胞又是肝癌的祖細胞，大量長期過度增殖有可能促進肝癌的發生發展，但其確切機制尚不明確。亟待解決的關鍵科學問題主要包括：①惡化的肝再生微環境(肝細胞再生受抑與卵圓細胞過度增殖)影響卵圓細胞從再生修復惡性轉化為肝癌及其異質性的關鍵環節及其機制；②在神經-內分泌-免疫-肝再生網絡紊亂狀態下的惡化再生微環境影響肝癌復發轉移的關鍵環節及其機制。③肝干細胞惡性轉化肝癌及其異質性演變過程中肝再生相關細胞與肝癌細胞的群體效應關鍵環節及其機制。目前正著手解決的關鍵科學問題之一是肝癌肝再生微環境影響肝癌腫瘤異質性(肝癌肝再生微環境影響肝干細胞惡性轉化肝癌及其異質性)的相關機制。

綜上所述，肝癌肝再生微環境是由人體內部肝再生修復機制的穩態系統受多種因素干擾而形成的偏態，系統干預是可靠的防治手段，明確肝癌異質性是提高“精準治療”可靠性的前提基礎，揭示肝癌肝再生微環境與肝癌異質性的相關機制，可極大促進系統干預與“精準治療”的結合，提高肝癌防治能力和水平。