miRNA對肝細胞癌微環境的調節作用*

曹 妮 孫建飛 魏海梁△ 李京濤 閆曙光 肖 剛

1.陜西中醫藥大學 2018級碩士研究生班 (陜西 咸陽, 712046) 2.陜西中醫藥大學附屬醫院

肝細胞癌(HCC)是最常見的原發性肝臟腫瘤,也是世界癌癥死亡的第3大原因,且發病率逐年增加，主要原因是臨床早期診斷困難,確診時多已錯過最佳治療時機。miRNA作為一種在惡性腫瘤發生中起到非常重要作用的短鏈非編碼RNA,通過與其靶基因的特異性結合從轉錄后水平調控腫瘤相關基因的表達[1]。自miRNA被發現以后，在多種生物體中發現并調查了更多的miRNA,目前，miRNA被公認為可以影響幾乎所有生物過程的關鍵中介，包括發育、免疫反應、分化、增殖、凋亡、入侵和轉移。本文從miRNA對HCC的免疫微環境、炎癥微環境、血管生成微環境等的調節作用進行綜述。

1 miRNA對肝星狀細胞及肌成纖維細胞的調節

肝癌微環境中存在著大量的肝星狀細胞(HSC)及肌成纖維細胞(MFC)，HSC是構成細胞外基質(ECM)的主要來源，HSC激活并轉化為MFC，各種致纖維化因素把HSC作為最終靶細胞。正常情況下HSC處于靜止狀態。當肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時，HSC被激活，其表型由靜止型轉變為活化的HSC。激活的HSC一方面通過增生和分泌ECM參與肝纖維化的形成和肝內結構的重建，另一方面通過細胞收縮使肝竇內壓升高。多種細胞因子和生長因子誘導的肝損傷可以激活HSC，產生α-smooth平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和引起肝纖維化后導致肝硬化，繼而形成HCC。miRNA通過不同的機制參與HSC的活化過程調節，從而造成不同的影響。

1.1 miRNA對HSC的活化過程的抑制 Han等[2]發現miR-206是HSC活化和肝纖維化背景下組蛋白去乙酰化酶4抗體(HDAC4)的另一個下游靶點，miR-206可能通過抑制肌鈣蛋白相關轉錄因子-A(MRTF-A)表達來抑制HSC的活化。Khanizadeh等[3]的研究結果表明，丙型肝炎病毒(HCV)中非結構蛋白3(NS3)蛋白不同于無蛋白酶功能的NS3蛋白，可以誘導人造血干細胞的成纖維狀態。miR-122可能直接調節纖維化，但其表達在纖維化狀態受到明顯抑制，在轉染NS3的完整和突變形式的HSCs后，對LX-2(人肝癌細胞的一種)細胞中miR-122的基因表達分析表明，與正常細胞或熒光蛋白對照質粒相比，兩種NS3蛋白均可導致HSCs中miR-122表達下調，但NS3的感受態形式對miR-122的抑制作用更強。

1.2 miRNA對HSC的活化過程的促進 Si等[4]的研究首次顯示轉化生長因子-β(TGF-β)是肝纖維化的調節因子,通過調控靶向RNA結合蛋白(如Igf2 bp3)的miRNAs(如Let7)來驅動造血干細胞的成肌成纖維細胞分化，它調節數千個基因表達的協調變化，使HSC能夠避免靜止，促進(并保持)增殖肌纖維蛋白。此外，miR-140-3p通過刺激蛋白同源(PTEN)基因的沉默促進p-AKT和p-mTOR的水平改善了細胞增殖以及α-SMA和結蛋白的表達，減少了細胞凋亡，并促進纖維形成[5]。

2 miRNA對線粒體微環境的調節

線粒體是細胞質細胞器，在能量代謝和細胞穩態中起多種作用，包括通過呼吸和氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(ATP)，活性氧的產生，代謝穩態以及細胞凋亡的啟動和執行，產生能量的電子傳遞鏈或三羧酸循環都位于線粒體內。miRNA主要位于細胞質或細胞核，miRNA通常通過蛋白復合物阻止其mRNA 靶點的翻譯，從而引起線粒體的一系列功能異常。

2.1 對呼吸鏈的影響 呼吸鏈又稱電子傳遞鏈(ETC)是一系列具有遞氫、遞電子作用的氫載體和電子載體蛋白，由還原型輔酶I、琥珀酸還原酶、細胞色素b-c1還原酶、細胞色素c氧化酶4種復合物組成。線粒體有內、外兩層膜，位于膜間隙中的電子傳遞鏈由幾個蛋白復合物(包括細胞色素c氧化酶)組成，它們產生質子梯度，通過ATP合酶驅動ATP合成。miRNA通過多種方式影響細胞核和線粒體基因的蛋白表達及ETC活性。①miR-338-5p能夠影響細胞色素c氧化酶IV和ATP合酶復合物亞基的表達；②在Hela細胞中進行的基因敲除實驗顯示，其蛋白水平降低了70%，miR-101-3p序列在人、大鼠和小鼠中均具有保守性，在小鼠肝臟的線粒體中也發現了成熟的miR-101-3p；③miR-127-5p調控ATP5B(ATP合成酶β5抗體)，可以使ATP5B蛋白的含量降低50%[6]。

2.2 對三羧酸循環的影響 糖酵解產生丙酮酸作為最終產物，它被丙酮酸脫氫酶轉化為乙酰輔酶A,在線粒體基質中，乙酰輔酶A進入三羧酸循環(TCA)。這導致了氧化還原當量的產生，它們進入ETC并驅動電化學質子梯度。檸檬酸合酶將乙酰輔酶A與草酸融合，催化三羧酸循環的起始步驟。anti-mir-122-5p處理小鼠可使脂肪酸生物合成降低40%，同時使β氧化增加2倍，通過平衡醛縮酶A的表達，mir-122-5p還參與控制糖酵解的破壞。而miR- 210-5p可以在TCA的多個點發揮負作用，對TCA循環代謝產生重要影響[6]。

2.3 對線粒體膜電位的影響 在電子傳遞過程中, 伴隨著質子從線粒體內膜的里層向外層轉移, 形成跨膜的氫離子梯度,這種勢能驅動了氧化磷酸化反應, 合成ATP。Lin等[7]利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫發現肝癌組織中miR-548b-3p的表達低于正常組織。miR-548b-3p模擬物和抑制劑分別轉染Huh7和SK-Hep-1(HCC細胞系中的一個)細胞，發現miR-548b-3p模擬下調的線粒體膜電位，而miR-548b-3p抑制劑在SK-Hep-1細胞中顯示相反的作用。miR-548b-3p通過直接靶向蛋白磷酸酶2A癌性抑制劑(CIP2A)下游靶蛋白c-myc基因發揮抑癌作用。CIP2A的消耗部分降低了miR-548b-3p模擬物/抑制劑對c-myc的影響。miR-548b-3p在HCC中被下調，而miR-548b-3p抑制劑上調了線粒體膜電位(MMP)。

2.4 對線粒體分裂/融合的影響 線粒體是動態的細胞器，其分裂和融合的平衡影響線粒體的形態，也幫助線粒體改變胞質定位，比如在需要大量ATP的組織積累，或Ca2+信號需要調節的地方積累。Mitofusin-2錨定在線粒體外膜上，參與線粒體分裂和融合。已經發現一些miRNA可以影響線粒體動力學[8]。①miR-761被發現通過靶向線粒體裂變因子抑制線粒體裂變和凋亡，miR-761對于維持線粒體分裂和融合之間的平衡以及細胞內穩態至關重要。Mitofusin-2是miR-761的直接靶點，它的過表達可通過觸發內質網Ca2+流入線粒體而誘導HCC細胞凋亡。此外，miR-761抑制劑通過上調Mitofusin-2而損害線粒體功能，并在體內和體外抑制腫瘤生長和轉移。②miR-30家族成員通過靶向線粒體裂變介質Drp-1.25調節細胞凋亡。③miR-140通過靶向Mitofusin-1促進線粒體裂變和凋亡。

3 miRNA對血管微環境的調節

惡性腫瘤的生長、滲透和轉移需要血管生成，包括HCC[9]。作為一種重要的多功能血管生成因子，血管內皮生長因子(VEGF)通過專門作用于血管內皮細胞(ECs)表面的受體來發揮其作用，這不僅促進血管ECs的線粒體增殖和分化，而且提高了毛細血管滲透性。目前諸多研究發現miRNA對腫瘤微血管有雙向調節作用。

3.1 miRNA對HCC血管生成的抑制作用 Ghosh等[10]發現在HCC組織中觀察到miR-199a-3p的表達明顯較低，并且其過表達顯著抑制了小鼠體內的腫瘤生長和肺轉移。miR-199a-3p通過干擾HSCs和CACs之間的血管內皮生長因子受體1(VEGFR1)、位于ECs上的VEGFR2分泌的促血管生成因子VEGFA，以及VEGFR2減弱的VEGF受體介導的下游信號血管生成素2之間的串擾和TME的基質成分抑制HCC的轉移、侵襲和血管生成。此外，該miRNA對肝臟微環境中多個信號分子的沉默表明miR-199a-3p限制了HCC的轉移、侵襲和血管生成。在人類HCC組織中，miR-26b的表達明顯下調。miR-26b顯著抑制磷酸肌醇3激酶(PI3K)/Akt和核因子-κB(NF-κB)/MMP-9/VEGF通路，繼而抑制細胞增殖，誘導凋亡以及增加肝癌細胞系Bax和caspase-3/9蛋白表達的作用[11]。miR-144-3p在HCC中經常被下調，可以通過PI3K獨立信號通路調節糖皮質激素激酶3激活來抑制增殖、遷移和抑制血管生成，并作為HCC患者的預后因子[12]。

3.2 miRNA對HCC血管生成的促進作用 Tong等[13]證實miR-338-3p在HCC組織和HCC細胞系中均被抑制。細胞遷移侵襲試驗和絨膜尿囊膜檢測，表明miR-338-3p的下調可以急劇增加，而上調則可以顯著抑制HCC細胞的血管生成。在HCC患者中，高miR-210表達與不良預后，無腫瘤生存期和總生存期顯著相關。此外，HCC中miR-210的表達與微血管密度顯著正相關，體內、外的研究均確定缺氧誘導的miR-210通過纖維母細胞生長因子(FGF)信號介導靶向調節成纖維細胞生長因子受體1(FGFRL1)表達和分泌促進HCC血管生成[14]。miR-195通過負調控，FGF2和VEGFA促進HCC的肺轉移[15]。miR-520f通過調節FGF16的表達促進HCC侵襲性[16]。

4 miRNA對免疫微環境的調節

目前研究發現,miRNA對HCC的發生、分化、轉移、凋亡等過程中免疫系統的影響主要分為促進免疫應答與抑制腫瘤的發生、發展以及逃避免疫監測，促進腫瘤發生與惡化兩方面。

4.1 參與免疫抑制的miRNA Ponsuksili等[17]研究豬肝miRNA表達的遺傳調節發現let-7家族mRNA的表達與血糖水平呈負相關，與紅細胞呈正相關，與淋巴細胞計數呈負相關。它還調節白細胞介素-13(IL-13)表達，并抑制適應性免疫反應，促進腫瘤的免疫逃避。miR-146a的表達是由異常激活轉錄激活因子3(STAT3)在肝癌細胞和施加負面影響抗腫瘤免疫反應調節的,從而導致TGF-β、IL-17、VEGF等細胞因子上調，Ⅰ型γ-干擾素(IFN-γ)則下調，從而產生了免疫抑制性微環境[18]。miR-200c的過度表達直接針對CD274的3'非翻譯區域(3′-UTR)，從而對抗乙型肝炎病毒(HBV)介導的PD-L1表達，并逆轉抗病毒CD8+T細胞耗盡從而抑制了HBV逃避宿主免疫監測[19]。miR-362-3p可作為介導腫瘤相關巨噬細胞中TGF-β途徑與腫瘤細胞中四聚體之間串擾的核心因子，從而促進上皮-間質轉化過程[20]。

4.2 參與免疫應答的miRNA miR-19a-3p通過靶向抑制Fra-1并抑制其下游基因VEGF、STAT3和p-STAT3來抑制M2巨噬細胞的極化，進而抑制細胞免疫逃逸及HCC的惡變[21]。miR-26b-5p導致分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IFN-γ、IL-6和2在CD4+和CD8+細胞，且miR-26b-5p通過靶向HCC中的pim2增強T細胞應答，通過重新激活免疫系統來抑制HCC的發生[22]。miR-570可抑制HCC增殖、血管生成和免疫逃逸[23]。

5 miRNA對炎癥微環境的調節

通過流行病學研究和實驗模型收集的數據顯示慢性炎癥與各種類型的癌癥之間的聯系，使炎癥在癌癥發展中的作用已得到公認。大多數癌癥組織表現出特定類型的炎癥反應，并被認為是腫瘤發生的重要組成部分。在80%～90%的HCC患者中發現了HBV和丙型肝炎病毒(HCV)。HBV是一種帶有雙鏈環狀DNA的包膜DNA病毒[24]。HBV整合到宿主基因組中，導致基因組不穩定。在大多數有HBV或HCV感染的HCC患者中都觀察到肝硬化，一些信號通路將炎癥和癌癥聯系起來，miRNA也在這些炎癥信號通路[如 NF-κB 、腫瘤蛋白(TP53)、AQP5和Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/STAT信號通路]中被觀察到，miRNA通過這些機制對HBV-HCC的過程產生不同的影響。

5.1 miRNA對JAK/STAT通路的影響 PI3Ks信號參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節，IA型PI3K和其下游分子蛋白激酶B所組成的信號通路與人類腫瘤的發生發展密切相關。該通路調節腫瘤細胞的增殖和存活,其活性異常不僅能導致細胞惡性轉化,而且與腫瘤細胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成以及細胞外基質的降解等相關。乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)誘導Il-6介導的STAT3信號轉導miR-21的上調通常會在炎癥纖維化軸的早期阻斷腫瘤抑制因子(如PTEN和PDCD4)，并在HBV-HCC階段繼續[25]。miR-124 還通過直接靶向STAT3和PIK3來抑制體外和體內HCC模型中的細胞增殖和腫瘤生長，從而抑制JAK/STAT和PI3K/AKT通路[25]。HBx下調Let-7，后者也可通過未能調節炎癥細胞因子的表達而激活STAT3信號，從而影響miRNA介導的關鍵腫瘤抑制因子的抑制[25]。

5.2 miRNA對AQP5通路的影響 水通道蛋白5(AQP5)高表達可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，重置細胞周期，促進上皮間質轉化和細胞遷移。與HBV相關的Huh7-1.3(正常細胞)和HepG2.2.15(HBV-HCC細胞)細胞中AQP5 mRNA和蛋白表達水平高于Huh7和HepG2細胞，HCC細胞生長需要AQP5。而過表達miR-325-3p抑制了HBV抗原的分泌，包括HBeAg和HBsAg，以及病毒cccDNA復制和細胞增殖，促進Huh7-1.3和HepG2.2.15細胞的凋亡[26]。

5.3 miRNA對Wnt/β-catenin通路的影響 在早期HCC中，Wnt/β-catenin通路的上調是一種常見事件，它產生一種與癌細胞的增殖、遷移、侵襲和存活有關的侵襲表型。抑制miR-181可顯著抑制肝腫瘤肝細胞(CSCs)的致瘤性，該miRNA通過激活包括caudal homeobox基因2和GATA6在內的轉錄因子，負調控Wnt/β-catenin通路，從而調控肝臟CSCs的分化潛能[27]。而HBx上調miR-155則阻斷了WNT通路中的APC腫瘤抑制因子，并通過阻斷增強子11抑制HBV復制，潛在地將病毒隱藏在宿主免疫系統之外[27]。

5.4 miRNA對NF-κB通路的影響 NF-κB信號通路是由細胞外的刺激引起的，NF-κB細胞對外界刺激以細胞的炎癥反應、免疫應答等方式起到關鍵性作用。miR-127-5p通過直接與HCC細胞的膽綠素還原酶B(BLVRB)3′-UTR結合抑制NF-κB的活性，進而抑制HCC細胞的生長和集落形成，降低BLVRB的表達[28]。

6 總結

HCC腫瘤微環境極其復雜，筆者此次僅查閱了其中的部分內容，除上述外還有如miRNA對DNA甲基化、腫瘤的Warburg效應、端粒酶等的調節[29-31]。總之，目前HCC仍是嚴重威脅人類健康的惡性疾病,我國肝癌新發和死亡病例均占全球半數以上[32]，由于HCC具有極大的異質性、進展快、易轉移的特點，雖然手術治療是最佳的治療方案，但根治切除率低且復發率高,而現在全球肝移植因技術及患者自身等因素，尚不能廣泛開展。近年來廣大學者對miRNA的深入研究涉及HCC的診治、預后，與臨床療效密切相關，所以重視針對腫瘤微環境與miRNA的研究,有助于進一步提高HCC的臨床療效。