耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

馬亞楠 王素梅 張健東

天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 300170

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，為條件致病菌，是引發(fā)院內(nèi)感染主要病原菌之一。碳青霉烯類抗生素是抗菌譜最廣，抗菌活性最強(qiáng)的非典型β-內(nèi)酰胺抗生素，是鮑曼不動(dòng)桿菌感染治療的主要藥物。近年來(lái)，由于該類藥物的廣泛使用，碳青霉烯類藥物的耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻。CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類的耐藥率由2005年的31.0%逐漸上升到2014年的66.7%[1]。鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯類耐藥株逐年增加，且多重耐藥、廣泛耐藥和全耐藥不斷出現(xiàn)，如不加以控制，臨床上將無(wú)藥可治。面臨耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌(Cabapenem resistant acinetobacter baumannii,CRAB)在我國(guó)范圍內(nèi)的爆發(fā)流行，探究CRAB的耐藥機(jī)制，為臨床鮑曼不動(dòng)桿菌感染的快速診斷、合理用藥和感染控制方面提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 碳青霉烯酶的產(chǎn)生

碳青霉烯酶是一種能水解大多數(shù)青霉素、亞胺培南與美羅培南等藥物的β-內(nèi)酰胺酶，分為A、B、D 3種類型。碳青霉烯酶有較為廣泛的水解范圍，能破壞亞胺培南或美羅培南等抗菌藥物中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，導(dǎo)致環(huán)內(nèi)的酰胺鍵斷裂，從而使抗菌藥物的活性消失[2]。與鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生耐藥性有關(guān)的主要碳青霉烯酶可分為兩大類，分別是B類金屬β-內(nèi)酰胺酶和D類苯唑西林酶。

B類金屬β-內(nèi)酰胺酶在鮑曼不動(dòng)桿菌中檢出較少。主要包括IMP、VIM、SIM、NDM 4型，其中NDM型金屬β-內(nèi)酰胺酶普遍存在于腸桿菌科細(xì)菌中，但相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明我國(guó)不動(dòng)桿菌NDM酶的攜帶率呈明顯上升趨勢(shì)，需引起相關(guān)重視[3]。IMP酶具有地方流行性，日本一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)由金屬β-內(nèi)酰胺酶引起的血流感染分離出的菌株，都含有IMP-1，并攜帶blaIMP-1基因與多重抗生素基因[4]。VIM酶的攜帶率僅次于IPM酶，主要存在于革蘭陰性菌中。研究表明，多氯聯(lián)苯能夠通過(guò)改變blaVIM的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)革蘭陰性菌對(duì)美羅培南的敏感性[5]。

D類苯唑西林酶(Oxacillinase，OXA)為不動(dòng)桿菌所特有，主要通過(guò)降低外膜蛋白的表達(dá)和(或)增強(qiáng)外排系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮其耐藥性。主要包括OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58等多種亞型。其中亞型OXA-23在CRAB攜帶率陽(yáng)性最高，在我國(guó)可高達(dá)80%以上。BlaOXA-23基因可以插入染色體與質(zhì)粒中，經(jīng)質(zhì)粒進(jìn)行傳播感染，是造成CRAB暴發(fā)流行的主要原因[6]。OXA-51基因是鮑曼不動(dòng)桿菌的固有基因，在鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥性中也起到關(guān)鍵作用。目前實(shí)驗(yàn)室采用熒光PCR的方法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌固有基因OXA-51基因和鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯類抗生素基因OXA-23基因，在CRAB的快速檢測(cè)中發(fā)揮著重要的作用。OXA-24和OXA-58的攜帶率較低，國(guó)內(nèi)相關(guān)的報(bào)道較少。

2 外膜蛋白的缺失或改變

鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制復(fù)雜，外膜蛋白的缺失或改變是CRAB形成的重要機(jī)制之一。正常狀態(tài)下，細(xì)菌外膜表面覆蓋有高度選擇性的膜孔蛋白，聚集成孔道，藥物通過(guò)孔道進(jìn)入并發(fā)揮藥效。當(dāng)外膜蛋白基因發(fā)生改變時(shí)，孔道便會(huì)發(fā)生阻塞甚至消失，阻礙藥物進(jìn)入細(xì)菌，細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)。

外膜蛋白A(Outer membrane protein A，Omp A)是革蘭陰性菌外膜蛋白的主要組成部分，是介導(dǎo)細(xì)菌生物膜形成、真核細(xì)胞感染、抗生素耐藥性和免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵毒力因子。研究發(fā)現(xiàn)Omp A對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性起重要作用，它不僅可以改變細(xì)胞外膜的通透性、抗生素結(jié)合靶位并促進(jìn)生物膜形成，還能結(jié)合宿主細(xì)胞表面的特定成分侵入最終導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡[7]。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)編碼對(duì)碳青霉烯類藥物有選擇性的孔蛋白的基因OprD2編碼基因的缺失與插入片段突變會(huì)使孔蛋白變性，導(dǎo)致進(jìn)入菌體的抗菌藥達(dá)不到有效作用濃度，從而增加菌體耐藥性[8]。

3 主動(dòng)外排系統(tǒng)的過(guò)度表達(dá)

耐藥結(jié)節(jié)分化家族(Resistance nodulation division family，RND)是引起不動(dòng)桿菌屬多重耐藥最重要的外排系統(tǒng)，由膜融合蛋白、RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和外膜蛋白三部分組成。當(dāng)下由于碳青霉烯類藥物大量不合理使用，使細(xì)菌固有的主動(dòng)外排系統(tǒng)表達(dá)增強(qiáng)，碳青霉烯類藥物被主動(dòng)外排出菌體外，阻礙藥物發(fā)揮作用，從而增加了CRAB的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。目前尚未研制出針對(duì)RND外排泵的有效藥物，探究外排泵的耐藥機(jī)制，尋找安全有效的外排泵抑制劑可有效緩解CRAB的發(fā)生。

RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白識(shí)別的藥物底物廣泛，是流行病學(xué)常用的檢測(cè)指標(biāo)。與鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥相關(guān)的RND外排泵主要有Ade ABC、Ade IJK、Ade FGH、Ade DE、Ade XYZ等類型。其中Ade DE、Ade XYZ比較少見，表達(dá)及調(diào)控機(jī)制等相關(guān)報(bào)道很少。

3.1 Ade ABC Ade ABC是最早發(fā)現(xiàn)的主動(dòng)外排泵，也是鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生多種耐藥的最重要原因，存在于大多數(shù)鮑曼不動(dòng)桿菌中。Ade ABC結(jié)構(gòu)基因分別由Ade A、Ade B、Ade C三個(gè)相連的基因組成，Ade A編碼膜融合蛋白、Ade B編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Ade C編碼外膜蛋白構(gòu)成三聚體，將抗菌藥物排出菌體外，從而產(chǎn)生耐藥性。一般情況下，Ade ABC表達(dá)低下或不表達(dá)，當(dāng)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥時(shí)，Ade ABC表達(dá)明顯增強(qiáng)[9]。有研究表明，Ade ABC外排泵過(guò)表達(dá)時(shí)，復(fù)合調(diào)控基因Ade SR序列未見有突變或插入序列，外排泵的過(guò)表達(dá)不是調(diào)控因子的突變引起的[10]。其他可能的機(jī)制如基因環(huán)境的改變對(duì)調(diào)控基因的影響有待進(jìn)一步的研究。

3.2 Ade IJK Ade IJK是第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)的主動(dòng)外排泵，與鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥密切相關(guān)，存在于大多數(shù)鮑曼不動(dòng)桿菌中。Ade IJK由Ade I膜融合蛋白、Ade J轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Ade K外膜蛋白組成。Ade IJK在過(guò)高表達(dá)時(shí)具有自身毒性特點(diǎn)，因此高表達(dá)水平低于Ade ABC。有研究表明，Ade IJK在亞胺培南耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌中陽(yáng)性率可高達(dá)90%，表達(dá)量較普通敏感株明顯增大[11]。Ade IJK的過(guò)度表達(dá)還介導(dǎo)了鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氟喹諾酮藥物的耐藥性[12]。

3.3 Ade FGH Ade FGH被發(fā)現(xiàn)時(shí)間是這三種主動(dòng)外排泵中最晚的，其耐藥性的研究較少。存在于鮑曼不動(dòng)桿菌中。Ade FGH和Ade ABC同源性較低，高表達(dá)時(shí)沒(méi)有自身毒性特點(diǎn)，在鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥中發(fā)揮著重要的作用。Ade FGH由結(jié)構(gòu)基因Ade FGH和位于上游的調(diào)控基因Ade L組成。Ade FGH形成有效的外排通道需要三個(gè)結(jié)構(gòu)基因Ade F、Ade G、Ade H共同表達(dá)來(lái)完成，主要參與β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類等藥物的主動(dòng)外排[13]。

4 生物膜的形成

生物膜是在細(xì)菌表面形成的一種多糖成分，是水平基因轉(zhuǎn)移的極好環(huán)境，可導(dǎo)致耐藥基因的獲得；同時(shí)，由于生物膜的形成，導(dǎo)致菌體內(nèi)部缺乏營(yíng)養(yǎng)，影響細(xì)菌對(duì)抗生素的反應(yīng)，從而使細(xì)菌耐藥性增加[14]。鮑曼不動(dòng)桿菌的廣泛流行與其黏附力強(qiáng)、容易在各種醫(yī)療器械上形成生物膜密切相關(guān)。具有生物膜形成能力的CRAB主要通過(guò)以下兩種機(jī)制提高耐藥性：(1)生物膜內(nèi)的高密度細(xì)菌能夠在一定程度上阻止抗菌藥物進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì)；(2)生物膜內(nèi)缺乏營(yíng)養(yǎng)空氣等條件，從而使細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，對(duì)抗生素不敏感[15]。生物膜的形成和碳青霉烯類耐藥性相互影響相互作用，使其具有強(qiáng)大的獲得性耐藥和克隆性傳播能力。國(guó)外一研究發(fā)現(xiàn)，生物膜不僅能夠使細(xì)菌在氣管導(dǎo)管上持續(xù)存在，還能導(dǎo)致與呼吸道有關(guān)的肺部疾病，因此在提高生物膜檢測(cè)水平的同時(shí)，治療時(shí)選擇一些具有清除生物膜作用的抗菌藥物，減少生物膜對(duì)患者的不良影響[16]。

5 藥物作用位點(diǎn)的改變

碳青霉烯類抗生素作用方式是抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin-Binding Proteins，PBPs)，從而阻礙細(xì)胞壁粘肽合成，使細(xì)菌胞壁缺損，菌體膨脹致使細(xì)菌胞漿滲透壓改變和細(xì)胞溶解而殺滅細(xì)菌。藥物作用位點(diǎn)發(fā)生改變會(huì)不同程度上影響細(xì)菌的耐藥性。喹諾酮是對(duì)不動(dòng)桿菌具有潛在抗菌活性的藥物之一，鮑曼不動(dòng)桿菌的靶位點(diǎn)基因gry A或par C的突變使藥物結(jié)合位點(diǎn)缺失是對(duì)喹諾酮產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制[17]。當(dāng)PBPs結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變時(shí)，青霉素和其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物與結(jié)合蛋白的結(jié)合能力減弱，從而使細(xì)菌抗藥性增強(qiáng)[18]。PBPs通過(guò)改變藥物作用位點(diǎn)，降低了與碳青霉烯類抗生素的結(jié)合能力，鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌能力增強(qiáng)，導(dǎo)致CRAB的產(chǎn)生。

6 小結(jié)

碳青霉烯類抗生素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌有較好的抗菌活性，是臨床治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的首選藥物。近年來(lái)，隨著此類藥物的大量使用，CRAB頻現(xiàn)并呈逐年上升的趨勢(shì)，現(xiàn)已成為WHO多重耐藥菌之首，給臨床感染控制方面帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)[19]。如何合理、及時(shí)用藥，避免新、特、貴等抗生素的盲目使用是臨床治療CRAB面臨的巨大壓力。耐藥機(jī)制的研究為臨床新藥的研究和臨床合理用藥提供了必要的理論基礎(chǔ)。目前，聯(lián)合用藥是治療耐藥細(xì)菌感染的有效方法，使用藥物組合可以通過(guò)降低藥物劑量要求，有效降低藥物的毒副作用，防止或延緩耐藥性的出現(xiàn)。

臨床標(biāo)本的常規(guī)培養(yǎng)是確診鮑曼不動(dòng)桿菌的常用方法，耗時(shí)長(zhǎng)且陽(yáng)性率低。尋找快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)方法提高鮑曼不動(dòng)桿菌的確診率，是攻克CRAB關(guān)鍵之一[20]。在充分了解耐藥機(jī)制的基礎(chǔ)上，將質(zhì)譜技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR、膠體金等新的檢測(cè)方法應(yīng)用到耐藥菌株的快速診斷和治療監(jiān)測(cè)上，對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥、緩解CRAB具有重大意義。