耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的耐藥機制研究進展

馬亞楠 王素梅 張健東

天津市第三中心醫院檢驗科 300170

鮑曼不動桿菌是一種非發酵革蘭陰性桿菌，為條件致病菌，是引發院內感染主要病原菌之一。碳青霉烯類抗生素是抗菌譜最廣，抗菌活性最強的非典型β-內酰胺抗生素，是鮑曼不動桿菌感染治療的主要藥物。近年來，由于該類藥物的廣泛使用，碳青霉烯類藥物的耐藥形勢嚴峻。CHINET中國細菌耐藥監測網數據顯示，鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類的耐藥率由2005年的31.0%逐漸上升到2014年的66.7%[1]。鮑曼不動桿菌碳青霉烯類耐藥株逐年增加，且多重耐藥、廣泛耐藥和全耐藥不斷出現，如不加以控制，臨床上將無藥可治。面臨耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(Cabapenem resistant acinetobacter baumannii,CRAB)在我國范圍內的爆發流行，探究CRAB的耐藥機制，為臨床鮑曼不動桿菌感染的快速診斷、合理用藥和感染控制方面提供重要的理論基礎。

1 碳青霉烯酶的產生

碳青霉烯酶是一種能水解大多數青霉素、亞胺培南與美羅培南等藥物的β-內酰胺酶，分為A、B、D 3種類型。碳青霉烯酶有較為廣泛的水解范圍，能破壞亞胺培南或美羅培南等抗菌藥物中的β-內酰胺環，導致環內的酰胺鍵斷裂，從而使抗菌藥物的活性消失[2]。與鮑曼不動桿菌產生耐藥性有關的主要碳青霉烯酶可分為兩大類，分別是B類金屬β-內酰胺酶和D類苯唑西林酶。

B類金屬β-內酰胺酶在鮑曼不動桿菌中檢出較少。主要包括IMP、VIM、SIM、NDM 4型，其中NDM型金屬β-內酰胺酶普遍存在于腸桿菌科細菌中，但相關實驗數據表明我國不動桿菌NDM酶的攜帶率呈明顯上升趨勢，需引起相關重視[3]。IMP酶具有地方流行性，日本一項研究發現由金屬β-內酰胺酶引起的血流感染分離出的菌株，都含有IMP-1，并攜帶blaIMP-1基因與多重抗生素基因[4]。VIM酶的攜帶率僅次于IPM酶，主要存在于革蘭陰性菌中。研究表明，多氯聯苯能夠通過改變blaVIM的表達來增強革蘭陰性菌對美羅培南的敏感性[5]。

D類苯唑西林酶(Oxacillinase，OXA)為不動桿菌所特有，主要通過降低外膜蛋白的表達和(或)增強外排系統來發揮其耐藥性。主要包括OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58等多種亞型。其中亞型OXA-23在CRAB攜帶率陽性最高，在我國可高達80%以上。BlaOXA-23基因可以插入染色體與質粒中，經質粒進行傳播感染，是造成CRAB暴發流行的主要原因[6]。OXA-51基因是鮑曼不動桿菌的固有基因，在鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥性中也起到關鍵作用。目前實驗室采用熒光PCR的方法檢測鮑曼不動桿菌固有基因OXA-51基因和鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類抗生素基因OXA-23基因，在CRAB的快速檢測中發揮著重要的作用。OXA-24和OXA-58的攜帶率較低，國內相關的報道較少。

2 外膜蛋白的缺失或改變

鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機制復雜，外膜蛋白的缺失或改變是CRAB形成的重要機制之一。正常狀態下，細菌外膜表面覆蓋有高度選擇性的膜孔蛋白，聚集成孔道，藥物通過孔道進入并發揮藥效。當外膜蛋白基因發生改變時，孔道便會發生阻塞甚至消失，阻礙藥物進入細菌，細菌的耐藥性增強。

外膜蛋白A(Outer membrane protein A，Omp A)是革蘭陰性菌外膜蛋白的主要組成部分，是介導細菌生物膜形成、真核細胞感染、抗生素耐藥性和免疫調節的關鍵毒力因子。研究發現Omp A對鮑曼不動桿菌的耐藥性起重要作用，它不僅可以改變細胞外膜的通透性、抗生素結合靶位并促進生物膜形成，還能結合宿主細胞表面的特定成分侵入最終導致靶細胞凋亡[7]。國外學者發現編碼對碳青霉烯類藥物有選擇性的孔蛋白的基因OprD2編碼基因的缺失與插入片段突變會使孔蛋白變性，導致進入菌體的抗菌藥達不到有效作用濃度，從而增加菌體耐藥性[8]。

3 主動外排系統的過度表達

耐藥結節分化家族(Resistance nodulation division family，RND)是引起不動桿菌屬多重耐藥最重要的外排系統，由膜融合蛋白、RND轉運蛋白和外膜蛋白三部分組成。當下由于碳青霉烯類藥物大量不合理使用，使細菌固有的主動外排系統表達增強，碳青霉烯類藥物被主動外排出菌體外，阻礙藥物發揮作用，從而增加了CRAB的發生風險。目前尚未研制出針對RND外排泵的有效藥物，探究外排泵的耐藥機制，尋找安全有效的外排泵抑制劑可有效緩解CRAB的發生。

RND轉運蛋白識別的藥物底物廣泛，是流行病學常用的檢測指標。與鮑曼不動桿菌多重耐藥相關的RND外排泵主要有Ade ABC、Ade IJK、Ade FGH、Ade DE、Ade XYZ等類型。其中Ade DE、Ade XYZ比較少見，表達及調控機制等相關報道很少。

3.1 Ade ABC Ade ABC是最早發現的主動外排泵，也是鮑曼不動桿菌產生多種耐藥的最重要原因，存在于大多數鮑曼不動桿菌中。Ade ABC結構基因分別由Ade A、Ade B、Ade C三個相連的基因組成，Ade A編碼膜融合蛋白、Ade B編碼轉運蛋白、Ade C編碼外膜蛋白構成三聚體，將抗菌藥物排出菌體外，從而產生耐藥性。一般情況下，Ade ABC表達低下或不表達，當鮑曼不動桿菌多重耐藥時，Ade ABC表達明顯增強[9]。有研究表明，Ade ABC外排泵過表達時，復合調控基因Ade SR序列未見有突變或插入序列，外排泵的過表達不是調控因子的突變引起的[10]。其他可能的機制如基因環境的改變對調控基因的影響有待進一步的研究。

3.2 Ade IJK Ade IJK是第二個被發現的主動外排泵，與鮑曼不動桿菌多重耐藥密切相關，存在于大多數鮑曼不動桿菌中。Ade IJK由Ade I膜融合蛋白、Ade J轉運蛋白、Ade K外膜蛋白組成。Ade IJK在過高表達時具有自身毒性特點，因此高表達水平低于Ade ABC。有研究表明，Ade IJK在亞胺培南耐藥的鮑曼不動桿菌中陽性率可高達90%，表達量較普通敏感株明顯增大[11]。Ade IJK的過度表達還介導了鮑曼不動桿菌對氟喹諾酮藥物的耐藥性[12]。

3.3 Ade FGH Ade FGH被發現時間是這三種主動外排泵中最晚的，其耐藥性的研究較少。存在于鮑曼不動桿菌中。Ade FGH和Ade ABC同源性較低，高表達時沒有自身毒性特點，在鮑曼不動桿菌多重耐藥中發揮著重要的作用。Ade FGH由結構基因Ade FGH和位于上游的調控基因Ade L組成。Ade FGH形成有效的外排通道需要三個結構基因Ade F、Ade G、Ade H共同表達來完成，主要參與β-內酰胺類和氟喹諾酮類等藥物的主動外排[13]。

4 生物膜的形成

生物膜是在細菌表面形成的一種多糖成分，是水平基因轉移的極好環境，可導致耐藥基因的獲得；同時，由于生物膜的形成，導致菌體內部缺乏營養，影響細菌對抗生素的反應，從而使細菌耐藥性增加[14]。鮑曼不動桿菌的廣泛流行與其黏附力強、容易在各種醫療器械上形成生物膜密切相關。具有生物膜形成能力的CRAB主要通過以下兩種機制提高耐藥性：(1)生物膜內的高密度細菌能夠在一定程度上阻止抗菌藥物進入細胞基質；(2)生物膜內缺乏營養空氣等條件，從而使細菌生長發育緩慢，對抗生素不敏感[15]。生物膜的形成和碳青霉烯類耐藥性相互影響相互作用，使其具有強大的獲得性耐藥和克隆性傳播能力。國外一研究發現，生物膜不僅能夠使細菌在氣管導管上持續存在，還能導致與呼吸道有關的肺部疾病，因此在提高生物膜檢測水平的同時，治療時選擇一些具有清除生物膜作用的抗菌藥物，減少生物膜對患者的不良影響[16]。

5 藥物作用位點的改變

碳青霉烯類抗生素作用方式是抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素結合蛋白(Penicillin-Binding Proteins，PBPs)，從而阻礙細胞壁粘肽合成，使細菌胞壁缺損，菌體膨脹致使細菌胞漿滲透壓改變和細胞溶解而殺滅細菌。藥物作用位點發生改變會不同程度上影響細菌的耐藥性。喹諾酮是對不動桿菌具有潛在抗菌活性的藥物之一，鮑曼不動桿菌的靶位點基因gry A或par C的突變使藥物結合位點缺失是對喹諾酮產生耐藥的主要機制[17]。當PBPs結構功能發生改變時，青霉素和其他β-內酰胺類抗菌藥物與結合蛋白的結合能力減弱，從而使細菌抗藥性增強[18]。PBPs通過改變藥物作用位點，降低了與碳青霉烯類抗生素的結合能力，鮑曼不動桿菌的抗菌能力增強，導致CRAB的產生。

6 小結

碳青霉烯類抗生素對鮑曼不動桿菌有較好的抗菌活性，是臨床治療鮑曼不動桿菌感染的首選藥物。近年來，隨著此類藥物的大量使用，CRAB頻現并呈逐年上升的趨勢，現已成為WHO多重耐藥菌之首，給臨床感染控制方面帶來了巨大的挑戰[19]。如何合理、及時用藥，避免新、特、貴等抗生素的盲目使用是臨床治療CRAB面臨的巨大壓力。耐藥機制的研究為臨床新藥的研究和臨床合理用藥提供了必要的理論基礎。目前，聯合用藥是治療耐藥細菌感染的有效方法，使用藥物組合可以通過降低藥物劑量要求，有效降低藥物的毒副作用，防止或延緩耐藥性的出現。

臨床標本的常規培養是確診鮑曼不動桿菌的常用方法，耗時長且陽性率低。尋找快速而準確的檢測方法提高鮑曼不動桿菌的確診率，是攻克CRAB關鍵之一[20]。在充分了解耐藥機制的基礎上，將質譜技術、實時熒光PCR、膠體金等新的檢測方法應用到耐藥菌株的快速診斷和治療監測上，對于指導臨床合理用藥、緩解CRAB具有重大意義。