激光共聚焦掃描顯微鏡觀測自噬小體變化的應用

張冰娜，葉丹彥，張丹桂，李 璐，楊旅軍

（汕頭大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學研究中心，廣東 汕頭 515041）

心血管疾病是世界范圍內危害人體健康的重要疾病，其中心肌梗死是心血管疾病的最常見疾病之一.在中國，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年升高，且呈現年輕化趨勢，嚴重危害著人們的健康，給社會和家庭帶來了巨大的經濟和精神負擔.研究報道[1]，心肌細胞損傷時細胞自噬參與疾病的整個過程并發(fā)揮著重要作用.細胞自噬（autophagy）是指細胞應對外部環(huán)境變化時的一種代謝方式，在基礎狀態(tài)下自噬水平較低，用于維持內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和細胞存活；在缺血缺氧條件下，細胞能量或營養(yǎng)供應不足，導致細胞自噬被顯著激活，激活的自噬小體可用于清除損壞的細胞器或侵入的病原體，廣泛參與各種病理生理過程[2].然而，其他研究指出缺血再灌注導致的細胞自噬過度激活，不利于心肌細胞存活[3].因此，準確觀測細胞自噬小體的變化情況對于理解心肌損傷機制并及時作出正確干預具有重要臨床意義.

目前，普通型正置熒光顯微鏡由于其高分辨率被廣泛用于對樣品結構和組成成分進行定位和定性檢測.然而，正置顯微鏡技術存在成像速度慢、精確度有限及熒光散射偽影重等不足.激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope，LCSM）作為一種先進的細胞分析儀器，具有高精確度、高分辨率、高靈敏性以及高放大倍數等特性，可以在細胞層面對樣本進行斷層、逐點、逐行和逐面等快速掃描成像，在生物醫(yī)學中具有廣泛應用價值[4].因此，本研究旨在利用激光共聚焦掃描顯微鏡技術檢測低氧誘導小鼠心肌細胞損傷自噬小體變化情況.

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

儀器：激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica TCS SPE），正置熒光顯微鏡（OLYMPUS BX51）.

試劑：含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基（美國，Gibco），0.25%胰蛋白酶，1倍的磷酸鹽緩沖液（PBS）.

細胞：胚胎小鼠心肌細胞.

1.2 低氧缺氧誘導小鼠心肌細胞自噬小體形成

將小鼠心肌細胞消化后接種于鋪有蓋玻片的六孔板中.待細胞長至80%，低氧誘導組換成缺氧液，于1% O2和5% CO2三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h后復氧1 h.

1.3 免疫熒光染色

將低氧缺氧誘導組和對照組的培養(yǎng)基去除干凈，PBS洗3次，3 min/次.加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，3 min/次.加入0.1% TritonX-100透化15 min，PBS洗3次，3 min/次.加入山羊血清工作液封閉20 min，去除血清，加入稀釋的LC3A/B一抗（1∶250，Cell Signaling Technology#4180）4℃孵育過夜.用PBS洗3次，3 min/次，避光加入稀釋的山羊抗兔熒光二抗（1∶500，碧云天，Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG（H＋L））37℃孵育1 h，用PBS洗3次，3 min/次，加入DAPI工作液細胞核襯染（碧云天，Irving Blue（0.5%，SIGMA）細胞漿襯染，PBS洗凈后，鏡檢.（見表1）

1.4 應用激光共聚焦掃描顯微鏡和正置熒光顯微鏡對圖片進行采集

激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica TCS SPE）采集：Alexa Fluor 488激光激發(fā)波長：480～495 nm；Irving Blue激光激發(fā)波長：543～575 nm；DAPI激光激發(fā)波長359 nm.同時采集綠色、紅色、藍色以及三色疊加圖.

正置熒光顯微鏡（OLYMPUS BX51）采集：選擇熒光濾鏡：1-DAPI、2-FITC、3-Rhod，分別采集藍色、綠色、紅色圖像，然后通過軟件將3圖進行合并.

2 結果

2.1 低氧缺氧誘導小鼠心肌細胞自噬小體形成

細胞在氯喹抑制下出現了明顯的自噬小體.利用低氧環(huán)境+缺氧液方法誘導小鼠心肌細胞損傷并自噬小體形成是可行的.與正常對照組比較，低氧缺氧誘導小鼠心肌細胞損傷組自噬小體呈高表達狀態(tài).

2.2 正置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡檢測自噬小體表達情況的差異

正置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡檢測自噬小體表達情況如圖1（見封3）.自噬小體分泌的抗原可以與Alexa Fluor 488標記的LC3A/B抗體結合，呈現綠色；DAPI襯染細胞核為藍色；Irving Blue襯染細胞漿呈紅色；3者疊加圖（Merge）可清晰觀察自噬小體在心肌細胞內的位置及表達情況.與正置顯微鏡比較，激光共聚焦顯微鏡成像速度快，圖像清晰及靈敏度高.

3 討論

細胞自噬是真核細胞內一種非常重要的生理過程，主要通過亞細胞膜結構的變化并經溶酶體介導對細胞內的細胞器、蛋白質和膜磷脂進行降解，維持細胞合成和代謝的平衡，進而維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定.本實驗結果發(fā)現低氧缺氧誘導小鼠心肌細胞損失可以引起自噬小體高表達，與既往類似研究適度刺激引起的細胞自噬作用對缺氧心肌細胞具有一定保護作用的結果基本一致[5].細胞自噬起始于自噬小體的形成，當細胞自噬被激活時，自噬小體表達的LC3發(fā)生膜型轉化，主要分布在細胞膜上；細胞自噬未被激活時，LC3仍停留在細胞漿內，呈散在塊狀分布[6].現在普遍觀點認為，在心肌病變早期細胞自噬被認為是一種保護性機制.然而，有研究指出過度激活細胞自噬，不利于心肌細胞的存活[3].因此，快速準確檢測細胞自噬時自噬小體的表達情況對于指導臨床干預具有重要應用價值.

免疫熒光法是目前檢測自噬小體的常用方法，主要儀器包括普通正置熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡.普通正置熒光顯微鏡由于操作方便、費用低和儀器比較普遍等特點被廣泛應用于實驗研究.然而，正置熒光顯微鏡在使用過程中只能局限于單個波長拍照，之后再合并不同通道的圖像，存在成像速度慢等缺點.另外，正置熒光顯微鏡會隨著次級熒光的干擾，使圖像清晰度下降，同時也會受曝光時間、增益影響，出現不同熒光染料的交叉干擾，無法在需要高靈敏度的實驗中獲取精確圖像[7].除此之外，正置熒光顯微鏡需要人肉眼觀察得出結果，存在主觀因素的干擾，無法客觀準確地對自噬小體的位置和含量進行評估.激光共聚焦掃描顯微鏡作為一種先進的熒光成像技術，主要利用激光作為掃描光源，采用光源針孔與檢測針孔共軛聚焦技術，對樣本進行快速的點、線或二維圖像成像[4，8].由于激光束的波長較短，光束很細，其分辨率大約是普通光學顯微鏡的3倍.另外，激光共聚焦掃描顯微鏡不僅可以通過多通道熒光捕獲技術同時獲取多標記熒光圖像，減少多色熒光之間的波段疊加，抑制圖像的模糊；還可以與其他多種先進技術兼容達到聯合應用的目的[9].總之，激光共聚焦掃描顯微鏡已成為分子生物學、形態(tài)學、細胞學、藥理學和遺傳學等領域強有力的研究工具.

隨著科學研究的不斷深入，激光共聚焦掃描顯微鏡在細胞結構[10]、核酸及蛋白質[11]、細胞內自由基活性[12]、細胞內鈣離子濃度變化[13]、膜電位[14]等生命科學研究中發(fā)揮重要的作用.近年來，新開發(fā)的高速活細胞雙轉盤式共聚焦系統(tǒng)進一步提高了檢測的靈敏度、圖像的采集速度，同時降低了光毒性.因此，激光共聚焦掃描顯微鏡具有檢測速度快、靈敏度高、定位精確和多色熒光成像等優(yōu)點，可以直接探測活細胞在化學因子、細胞因子或激素等作用下所致的離子細微動態(tài)變化，是目前檢測自噬小體變化的最為先進儀器之一.