液體活檢在肺癌診治中的應用和挑戰

吳珍 趙微 戴鈺 陳良安

解放軍總醫院第一醫學中心呼吸與危重癥醫學科，北京100853

肺癌作為病死率最高的惡性腫瘤[1]，極大地危害了人類的健康和影響了社會經濟的發展。肺癌傳統的診斷手段以組織病理活檢為金標準，但由于腫瘤異質性、患者自身不耐受等原因使得組織活檢在臨床應用中具有一定的局限性。液體活檢則能較好地彌補上述不足，從早期篩查到指導個體化診療，應用廣泛且意義重大。

一、液體活檢的發展史

液體活檢指應用來源于人體循環的體液樣本進行疾病相關分子的檢測來指導疾病的診療，其不僅用于腫瘤疾病的輔助診療，還在產前診斷、心血管疾病、慢性腎病、腦卒中等疾病的診治中發揮重要作用[2-5]。在腫瘤的液體活檢中應用最廣泛的為循環游離DNA (cell free DNA，cf DNA)。cf DNA由Mandel和Metais于1948年發現并報道，是一種存在于人體體液中且游離于細胞之外的核酸，主要由凋亡或壞死細胞釋放而成[6]。而后，腫瘤患者外周血中被證實含有更多的cf DNA。1994 年，Vasioukhin等[7]在腫瘤患者cf DNA 中發現了腫瘤相關的RAS基因突變。這部分含有腫瘤相關突變的cf DNA 稱為循環腫瘤DNA (circulating t u mor DNA，ct DNA)，來源于凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放、循環腫瘤細胞 (circulating tu mor cell，CTC)或外泌體等[8]。隨后更多的研究發現ct DNA 可反映腫瘤組織基因組變異和表觀遺傳學等改變，進一步提升了液體活檢在腫瘤診療領域的應用與進展[9-10]。

CTC是另一種常見的液體活檢技術，1869年由Ash wort h發現腫瘤患者外周血中存在與腫瘤細胞相似的細胞，提出了CTC的概念[11]。直到2003年，CTC才被完全定義：一方面為來源于原發灶或轉移灶的腫瘤細胞通過毛細血管入侵血液循環系統進入血管形成，另一方面為腫瘤細胞獲得間質上皮轉化使得細胞的侵襲能力增強入侵基底膜而形成[12]。隨著單細胞測序技術的發展，CTC 所具有的基因組信息被深入挖掘，被證實與腫瘤原發灶和轉移灶存在相似的基因譜，其在腫瘤疾病診治中的作用越來越突出，有望成為補充和替代腫瘤組織的體液樣本。且CTC 獲取方便，可實現動態監測，有助于腫瘤診療過程中的個體化動態指導[13-14]。

二、液體活檢在肺癌診治中的應用

液體活檢以其安全、無創和可重復檢測的優勢廣泛應用于肺癌臨床診療，為肺癌的早診提供了安全有效的方法，給不能耐受組織活檢的患者提供了靶點檢測的機會，對治療過程中的隨訪和監測也提供了一定的便利，并且減少了耐藥后不必要的再活檢，貫穿于肺癌患者的全程診療過程。

(一)肺癌患者的早期診斷

大多數肺癌患者早期時無明顯癥狀，且目前缺乏有效的早期診斷方法，使得多數患者確診時已處于晚期。盡管美國國立衛生研究院于2011年發表研究結果證實低劑量CT 篩查可以降低20%的肺癌病死率以及6.7%的總死亡率，但是低劑量CT中高達96.4%的假陽性率導致不必要的過度醫療和輻射暴露[15]。液體活檢技術通過對其中cf DNA、微小RNA (micro RNA，mi RNA)、CTC 和腫瘤血小板進行檢測可實現肺癌的早期診斷，有望成為將來肺癌早診的又一大策略。早在20世紀，研究中就發現腫瘤患者外周血中的cf DNA 含量比普通健康者更多[16]。Chabon 等[17]利用深度測序的方法，再結合機器學習，將早期肺癌患者血漿中的cf DNA 與風險匹配對照組血漿中的cf DNA 進行差異分析，前瞻性地建立并驗證了一種稱為“血漿中肺癌可能性” (Lung-CLi P)的機器學習方法用于早期肺癌的篩查。研究者們從TCGA 數據庫中篩選出3個與肺癌相關性高的mi RNA：mi R-21-5p、mi R-103-3p、mi R-126-3p，聯合這3個mi RNA 在肺結節患者中進行肺癌篩查的敏感度可達到81.2%，而與胸部CT 聯合診斷可使得肺癌早診的敏感度上升到89.9%[18]。對mi RNA 的聯合應用還可進一步區分早期肺癌的病理分型，Lu等[19]研究表明應用3 個mi RNA 分子 (mi R-17、mi R-190b、mi R-375)可區分小細胞肺癌與非小細胞肺癌，敏感度和特異度可分別達到82%和84%。肺癌特異性抗體聯合胸部CT 進行肺癌早期篩查的陽性預測值可達95%，高于單獨應用胸部CT(69%)或特異性抗體 (85.2%)的陽性預測值[20]。借助于液體活檢，能夠以更加安全、易于接受的方法提高肺癌早診的普及性，并且與目前已有的影像學篩查結合具有更高的敏感度，可進一步提高肺癌早診的陽性率，做到早發現、早治療，進而改善肺癌患者的整體生存質量，并延長生存期。

(二)肺癌患者的靶點檢測

目前指南推薦非小細胞肺癌確診后應首先進行驅動基因檢測以明確下一步治療方案[21]。盡管靶點檢測的金標準仍是組織分子檢測，但由于患者身體的耐受性以及腫瘤異質性導致的單次活檢的局限性使得組織活檢在臨床的應用受限[10，22-23]。采用全身外周體液中的cf DNA、CTC、外泌體、TEP 等進行分子靶點的檢測，以安全簡便、易于動態監測的特點廣泛應用于臨床以指導個體化精準診療。從Bai等[24]用高性能液相質譜檢測外周血ct DNA 中EGFR 突變，到后來實時熒光定量PCR 的應用，液體活檢在非小細胞肺癌患者靶點檢測中的應用越來越廣泛。而基于熒光定量PCR 平臺的Cobas檢測技術被美國食品藥品監督管理局批準用于液體活檢檢測EGFR 已知突變位點 (19 外顯子缺失、L858 R 點突變和T790 M 突變)[25]。隨著檢測技術的不斷發展，使得液體活檢在分子檢測中的敏感度能夠進一步提升，更好地滿足臨床診療需求。目前二代測序進行液體活檢在驅動基因檢測中的一致性可以達到90%以上，且轉移灶數目越多的患者血漿檢測驅動基因的敏感度和一致性越高[26-27]。目前液體活檢所覆蓋的分子譜也越來越廣泛，既滿足了非小細胞肺癌臨床診療中的常見分子靶點EGFR和ALK 等基因的檢出，也能發現更多驅動基因的未知位點，還能進一步進行耐藥機制的深入探討[28-30]。

(三)肺癌患者的耐藥監測

耐藥是肺癌患者治療過程中不可避免的結局。耐藥后的分子檢測仍然以組織檢測為金標準。由于多數患者耐藥后身體狀況無法耐受有創的耐藥后再活檢，使得多數患者在耐藥后失去進行分子檢測的機會。安全微創的液體活檢再次解決了這一難題。研究發現，與組織樣本相比，耐藥患者血漿樣本檢出T790 M 的一致性可達70%以上，且胸腔外轉移患者血漿檢出T790 M 突變的陽性率更高[31-32]。一代EGFR-TKI耐藥患者的血漿中能夠早于影像學進展2個月檢出T790 M 的存在，有助于患者的耐藥監測，以便盡早發現耐藥[33]。由于腫瘤的異質性導致單次組織活檢檢出的耐藥基因譜不全，而來自外周循環的體液樣本同時包含了腫瘤原發灶和轉移灶的腫瘤分子背景，能夠較全面地檢出耐藥基因譜[34]。Tho mpson等[35]研究表明耐藥患者外周血能檢測到腫瘤組織無法檢出的T790 M 耐藥突變，進一步為耐藥患者提供有效的治療方案。液體活檢再次為耐藥患者提供了安全便利的分子檢測方法，不僅有助于檢出耐藥基因，還能早于臨床影像學評估就監測到耐藥的出現，并且還能彌補腫瘤組織異質性導致的腫瘤耐藥譜不全，更好地指導耐藥患者的后續治療。

(四)肺癌患者的預后評估

越來越多的研究還證實利用液體活檢進行疾病監測，可以評估和預測患者的預后。在早期肺癌患者術后，外周血中檢測ct DNA 或CTC陽性組的患者術后1年復發率和術后2年復發率均高于陰性組[36]。TRACERx研究納入了100 例早期肺癌術后的患者通過ct DNA 來監測驅動基因數目的變化，結果表明，以ct DNA 監測驅動基因數目大于等于2個作為復發的標志，其敏感度和特異度可達到93%和90%，并且可早于影像學進展之前預測復發的出現[37-39]。液體活檢對靶向治療的預后同樣具有一定作用，BENEFIT 研究證實血漿檢測EGFR突變陽性患者接受一代EGFR-TKI的客觀緩解率為72.1%，中位無進展生存期為9.5個月。同時在接受治療后的第8周，血漿EGFR 轉陰的患者可獲得更長的無進展生存期[40]。初治時EGFR 突變的頻率也被認為與一代EGFR-TKI治療的預后相關：突變頻率大于5.15%的患者接受一代EGFRTKI治療獲得的無進展生存期長于EGFR 突變頻率小于5.15%的患者 (15.4個月比11.1個月)[41]。血漿中ALK 突變頻率的動態變化同樣可以評估ALK 抑制劑的療效[28]，動態監測BRAF突變頻率的降低也可提示相關的靶向治療有效[42]。

三、液體活檢在肺癌診治中的挑戰

(一)檢測樣本的選擇

作為臨床檢測最常見的標本之一，外周血樣本是最早應用于肺癌患者液體活檢的樣本，其獲取方便，檢測敏感度高，在肺癌診療中的應用也最為廣泛。但是，研究者發現，來自于多數肺癌患者外周血中的ct DNA 量占總體cf DNA 的比值小于1%，且受腫瘤分期、患者病灶部位、腫瘤負荷等因素影響而使外周血ct DNA 檢測存在一定的局限性[43-45]。近些年來，除外周血以外的其他樣本也逐漸被用于肺癌患者的液體活檢中。痰液樣本作為呼吸系統疾病最常見的標本之一，其中含有大量的cf DNA[46]。研究證實，肺癌患者cf DNA 可以用于驅動基因檢測，盡管在驅動基因檢測中的一致性不如外周血，但是其可以檢測到外周血無法檢測到的基因突變，兩者聯合可以檢測到更多的腫瘤分子靶點，且吸煙患者的痰液cf DNA 檢測驅動基因的一致性高于非吸煙患者[47]。基于尿液樣本的液體活檢也被證實與組織樣本具有較好的一致性[48]，與血液樣本的聯合可以檢出更多的驅動基因變異[49]。尿液樣本cf DNA 進行T790 M 的動態監測還可以評估奧希替尼的早期療效[50]。胸腔積液作為肺癌患者的常見標本之一，在檢測驅動基因中的價值較外周血更勝一籌。胸腔積液上清液中的cf DNA 檢測到的腫瘤突變負荷 (tu mor mutation bur den，T MB)與腫瘤組織中檢測到的T MB相似，高于外周血cf DNA檢測到的T MB。在檢出的EGFR 突變頻率比較中也是胸腔積液cf DNA 高于外周血cf DNA[51]。而腦脊液在肺癌腦轉移患者驅動基因檢測中的敏感度和一致性也要高于外周血樣本，并且腦脊液cf DNA能夠檢出更多的驅動基因拷貝數變異[52]。越來越多的體液樣本用于液體活檢，在樣本選擇中我們應該根據患者臨床特點和疾病特征，結合標本獲取的可行性來有針對性的選擇最適合的樣本，提高液體活檢在肺癌診療中的應用價值。

(二)檢測成分的取舍

大量研究表明cf DNA 是液體活檢中應用最多的生物標志物，其次是CTC。CTC 來源于原發或轉移灶并具有通過循環系統傳播到遠處形成轉移灶的潛能，攜帶腫瘤相關分子譜，可以用于腫瘤診斷和評估預后。與健康對照組相比，早期肺癌患者外周血中能檢測到一定數目的CTC[53]。利用二代測序技術可以進行CTC 全基因組擴增測序或單細胞全外顯子測序，了解腫瘤特異性的分子變異，評估耐藥和分析表型轉化[13]。另外，CTC 在融合基因檢測中更具優勢。利用CTC 中的RNA 測序進行ALK 等融合基因變異檢測，與組織分子檢測相比具有較高的一致性，并且能夠根據其動態變化預測ALK 抑制劑的療效[54]。但CTC 由于其在外周血中的稀缺性、CTC表型的變異性以及單個CTC 下游分子分析的局限性，使得其在臨床中的應用有待進一步提高和改善[55]。外泌體是一種具有脂質雙層膜結構的微小囊泡，其在腫瘤患者外周體液中含量豐富，其內含有大量的核酸分子，由于外泌體表層的脂膜結構使得包含其中的DNA 和RNA 較cf DNA 更加穩定，且外泌體由活細胞分泌，具有很好的腫瘤特征代表性[56]。二代測序檢測外泌體DNA 中的驅動基因變異，可達到95%的敏感度，并且外泌體DNA 中所檢測的驅動基因頻率還可進一步指導肺癌患者的預后[26]。應用外泌體中的DNA 和RNA 分子進行T790 M 耐藥檢測，可獲得92%的敏感度，而傳統的液體活檢應用ct DNA 檢測T790 M 突變的敏感度僅為58%。應用外泌體核酸可以使得一代EGFR-TKI耐藥患者不必要的再活檢率從42%下降到8%[57]。但目前外泌體的獲取和鑒定方法尚無統一標準，其臨床應用有待進一步驗證和推廣[58]。除此之外，循環RNA 和腫瘤教育血小板在肺癌早期診斷中也有一定的價值，為肺癌患者的液體活檢提供了更多的選擇方式[59-60]。

(三)檢測方法的權衡

目前多種方法用于液體活檢，基于熒光定量PCR 平臺的Cobas、數字PCR 和二代測序是常見的3種檢測方法。Cobas是目前美國食品藥品監督管理局批準用于臨床患者液體活檢的檢測方法，其檢測周期短，成本低，覆蓋EGFR 基因的臨床常見和已知位點，但是多中心的研究顯示其敏感度只有72.1%[61]。數字PCR 是一種絕對定量方法，其敏感度高于普通PCR[62]，且檢測閾值能覆蓋低頻突變位點，對于肺癌患者治療過程中已知靶點的動態監測意義顯著，有助于治療過程中的療效預測和耐藥監測[33]。二代測序是一種高通量測序方法，可一次檢測包括點突變、缺失、融合、拷貝數變異等多個基因的多種已知和未知變異類型，節約樣本，一次檢測覆蓋所有待檢測的基因[63]，尤其對耐藥基因的探索有重要意義，且具有較高的敏感度[64]，但檢測周期往往需要1～2周，價格成本較昂貴。針對不同患者的臨床需求，應選擇不同的檢測方法使液體活檢更好地服務臨床，指導患者的精準診療。

(四)免疫治療中的應用價值

免疫治療是肺癌診治領域繼靶向治療后又一里程碑式的進展，給許多肺癌患者帶來新的希望。在免疫治療獲益人群的挑選上，NCCN 指南依然推薦 在PD-L1 陽 性 且 EGFR、ALK、ROS1 和BRAF陰性或突變狀態未知的晚期非小細胞肺癌患者使用免疫治療[21]。PD-L1 表達以組織檢測為金標準，但部分晚期患者由于不能耐受組織活檢而無法進行PD-L1 表達的檢測。研究者發現外周血CTC同樣可以用于PD-L1表達的檢測，并且能夠進行免疫治療的療效預測，但是其與組織PD-L1表達的一致性有待進一步提高[65]。除PD-L1表達以外，T MB是免疫治療另一熱門標志物[66]，利用外周血進行T MB可以通過界定閾值實現免疫治療的療效評估[67]。但無論是組織檢出還是液體活檢，目前對于T MB的檢測標準仍然沒有統一定論。微衛星不穩定性檢測也為實體瘤免疫治療的療效評估提供了一定的依據[68]，液體活檢同樣為其檢測帶來了新的途徑，并且經外周血檢測的微衛星不穩定性與組織相比具有98.4%的一致性[69]。

毫無疑問，液體活檢為肺癌患者的診治提供了有力幫助，讓更多的患者從中獲益。基于檢測技術的不斷進展，液體活檢在靶點檢測中已經與組織分子檢測有很好的一致性，為后續治療過程中的動態監測和耐藥檢測打下了堅實的基礎。作為一項新興技術，液體活檢仍然存在一定的挑戰。外周循環中ct DNA、CTC等物質的量和穩定性受腫瘤分期和腫瘤負荷的影響，會影響液體活檢在臨床應用中的敏感性。CTC、外泌體的分離和獲取也是限制其臨床應用的重要因素。另外，如何更好地利用液體活檢輔助免疫治療也是其未來的發展方向。借助于科學技術的不斷進展，未來液體活檢必將以其安全、便捷的優勢更好地應用于肺癌患者的臨床診療實踐。

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