錫林郭勒奶酪中優良菌株的篩選及奶豆腐制作

徐偉良 郭元晟,2 王福超,3 李春冬 安琪 雅梅,2 郭梁,2

(1.錫林郭勒職業學院生物工程研究院，內蒙古 錫林浩特 026000；2.錫林郭勒盟食品科學與檢測實驗中心/錫林郭勒盟農畜產品檢驗檢測中心，內蒙古 錫林浩特 026000；3.延邊大學農學院食品與生物科學系，吉林 延吉 133002)

錫林郭勒奶酪主要是指牛乳經過自然發酵凝乳最終形成的一種食物，屬于錫林郭勒地區特有的傳統固體類奶制品，也是錫林郭勒地區蒙古族傳統奶制品中非常重要的一類食品。2020年經農業部審定，錫林郭勒奶酪成為國家農產品地理標志登記產品，其傳統的制作工藝不僅展現著民族的文化特色與精粹，更包含著豐富的科學內涵與教育意義。錫林郭勒奶酪是一種多以凝乳酪蛋白為最終產品形式的高蛋白類乳制品，常見產品種類包括浩乳德(俗稱奶豆腐)、畢希拉格(俗稱熟奶豆腐)、楚拉(俗稱奶渣子)、阿爾沁浩乳德(俗稱酸奶豆腐)等[1,2]。日常生活中以四方塊模具為主，在重大節日中則用不同的模具制作浩乳德。錫林郭勒奶酪其營養價值較高，含有大量的蛋白質、脂肪酸、維生素、鈣、磷及微量元素。氨基酸比例平衡，必需氨基酸含量較高，消化率接近，脂肪酸含量較高，尤其是不飽和脂肪酸含量高，是老人小孩補充鈣、磷、鋅等元素的良好食物，補充人體各種必需營養，已成為蒙古族人們必需食物之一[3-5]。

錫林郭勒奶酪不僅含有大量營養成分和特色風味營養物質，更蘊含著優異發酵性能和特色風味等極其豐富的益生菌資源，對營養保健功能食品和商業發酵菌劑的研發開發具有巨大潛力，已越發受到研究人員的重視，逐漸成為益生菌資源研究的熱點[6]。目前已有報道從錫林郭勒傳統奶酪中分離得到了植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)和乳酸片球菌(Pediococcusacidi lactici)等一部分具有益生活性的乳酸菌[7-10]。本實驗以錫林郭勒傳統發酵奶酪為原料，通過產酸凝乳發酵性能為評價指標對優良發酵性能的乳酸菌株進行分離篩選，并以此用于生產加工均有良好營養品質的錫林郭勒奶酪，從而為錫林郭勒奶酪發酵劑的開發和新式奶豆腐品的研制提供技術依據。

1 實驗器材與試劑

1.1 材料

試驗菌株，由錫林郭勒職業學院生物工程研究院提供，其中編號B009系列乳酸菌株由錫林郭勒地區傳統奶酪中分離獲得。具體分離純化步驟：將在牧民家采集的蒙古族傳統奶酪(靜置發酵奶酪、攪拌發酵奶酪)攪拌均勻，將其裝入無菌采樣袋中，并編號和記錄，送回實驗室，添加篩選抗生素后利用涂布法進行菌種分離。并挑取不同形態菌株于液體培養基中進行純化及后續保存。

發酵用牛奶，采購于伊利集團市售滅菌純牛奶。

1.2 培養基與試劑

MRS固體培養基購于北京路橋技術股份有限公司；TaKaRa快速提取試劑盒(Code No.9164)購于大連寶生物工程有限公司；其它試劑藥品均為國藥分析純試劑。

1.3 儀器與設備

Eppendorf 5418R Centrifuge高速臺式離心機，德國艾本德股份公司；Nanodrop 2000c核酸蛋白質分析儀，美國Thermo Fisher公司；2720 Thermal Cycler PCR擴增儀，美國BIO-RAD公司；瓊脂糖凝膠電泳系統，北京六一生物科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 菌株產酸凝乳能力篩選

將51株菌取出并復蘇后，用MRS液體培養基連續不間斷活化3代，按2%的接種量接種于裝有市售純牛奶的試管中，放置于37℃的條件下進行培養。并以發酵8h時的酸度>80oT(吉爾涅爾度)及常溫凝乳狀態(有無凝乳、凝塊是否均勻、潤滑，乳清是否析出以及發酵感官風味)設為篩選的標準，進行產酸凝乳菌株的初步挑選。參照國標GB 5009.239-2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》中的方法滴定樣品酸度[11]。

2.2 菌株產酸凝乳能力復篩

將滿足初步篩選條件得到的菌株，再次按照初篩的接種比例加入到100mL純牛奶的三角瓶中進一步擴大培養，并以最終發酵8h時常溫凝乳狀態和加熱凝乳狀態(凝乳是否成團、凝塊的顏色、乳清澄清程度、感官風味)綜合因素作為篩選的標準，從而再次進行產酸凝乳菌株的復篩。

2.3 菌種PCR擴增及序列鑒定

采用TaKaRa快速提取試劑盒對篩選菌株的基因組總DNA進行提取。選用細菌通用引物(27F/1495R)用于擴增。引物序列分別為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1495R(5′-CTACGGCTACCTTGTT ACGA-3′)。

PCR反應體系(20μL)，模板DNA 1μL、引物各1μL、ddH2O 7μL、Easy Taq PCR Super Mix 10μL。反應條件，94℃預變性5min；94℃變性1min、58℃退火1min、72℃延伸2min，共30循環；72℃末端延伸10min。

擴增產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，經檢測后合格的擴增產物送至北京睿博生物科技有限公司進行測序，測序結果經拼接后在美國國立生物技術信息中心(national center for biotechnology formation.NCBI)進行BLAST同源比對。

2.4 奶豆腐的制作

2.4.1 奶豆腐制作工藝流程

菌種經過產酸凝乳能力篩選后，把篩選得到的3株菌按照1∶1∶1的比例混合制成復合菌種。在無菌條件下，將復合菌種按3%比例接種到1L市售全脂滅菌牛奶，然后放置于25℃常溫下，模擬自然條件進行靜置發酵24h。隨后進行酸度滴定，若酸度達65oT以上，且發酵凝乳伴有少量乳脂析出，則發酵達到終點，否則繼續發酵至終點。

制作流程：把發酵好的凝乳倒入鍋中進行加熱排乳清，溫度控制在50～60℃，并保持10min，為了乳清的排出需要保持不停攪拌，并使其受熱均勻；待凝塊慢慢收縮至原來大小的1/2時，且凝乳富有彈性時，用濾網把乳清排出；將過濾掉乳清的凝乳塊繼續進行加熱攪揉，溫度控制在70℃以上，待凝乳經攪揉成團后，取出放入模具成型。

2.4.2 奶豆腐的品質評定

奶豆腐制作完成后，放在陰涼干燥環境下晾曬16h，揮發部分水分后計算奶豆腐得率，見公式1。抽選15位食品專業具有相關感官評定資質的檢測人員以外觀色澤、口感、氣味、組織狀態以及融水狀態幾個方面為標準對制作得到的奶豆腐進行感官評分，主要是對奶豆腐進行風味和質地的打分，評分標準見表1。并將奶豆腐樣品參照國標GB 5009.3-2016[12]、GB 5009.5-2016[13]、GB 5009.6-2016[14]進行水分、蛋白質、脂肪檢測。

表1 奶豆腐感官評分表

奶豆腐得率(%)=奶豆腐成品質量/原料乳的質量×100%

(1)

3 結果與分析

3.1 菌株產酸凝乳能力篩選結果

產酸能力通常是用于評價乳酸菌活力和篩選優良發酵性能菌株的重要指標。乳酸菌經過發酵后，會將乳中的乳糖、蛋白質等逐漸分解,不僅產生一些有機酸和小分子肽等營養成分，還能為發酵食物賦予一些獨特的風味[15]。因此，產酸能力是乳酸菌發酵功能里的一個非常重要的指標，并且酸的生成能力與發酵時間成反比。此外，凝乳程度也是影響發酵乳制品生產過程中的關鍵因素，尤其是在蒙古族乳制品傳統制作過程中，一般會通過調控加熱凝乳過程來達到可控的產品品質與風味[16,17]。本實驗對分離于錫林郭勒傳統奶酪中的51株菌株，以37℃的條件下，發酵8h，酸度達到>80oT進行初篩，并以最終常溫凝乳狀態和加熱凝乳狀態等綜合因素作為篩選的標準進行復篩。初篩結果見表2，復篩結果見表3。

由表2、表3可知，根據初篩標準，共有13株具有較好產酸能力的菌株，酸度均達到80oT以上，其中酸度最高可達87oT，且初篩菌株常溫凝乳狀態均相對較好。然后對初篩所得13株菌進行了復篩，最終得到了酸度、常溫凝乳狀態和加熱凝乳狀態均較好的菌株，分別為B009-074、B009-089和B009-092。

表2 菌株的產酸凝乳能力篩選

表3 產酸凝乳菌株復篩結果

3.2 菌種序列鑒定結果

為最終確定后續奶豆腐制作所用的發酵菌株，同時鑒別初篩菌種的多樣性，因此將篩選所得的13株菌同時進行分子鑒定。總DNA提取和瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果如圖1所示(R1～R13)。序列測序同源比對后，鑒定結果見表4。由表4可知，經產酸凝乳篩選得到的13株分離于錫林郭勒傳統奶酪中的乳酸菌經過測序后，結果顯示皆為乳酸乳球菌(Lactobacillus lactis)，并且其同源相似性均為100%。這與前期研究文章中從蒙古族奶嚼口與下層凝乳中乳酸菌的篩選結果所得的種類相似，均為乳酸乳球菌[18]。此外，莫藍馨等從16份錫林郭勒盟傳統發酵乳制品中分離得到了105株乳酸菌株，多數歸屬于乳球菌屬[19]。因此本實驗最終篩選出的13株菌均為乳酸乳球菌(L.lactis)，與上述兩位學者研究中的菌種屬種基本相同。

圖1 13株乳酸菌(R1～R13)的PCR擴增產物電泳結果注：R1～R13為產酸凝乳菌株復篩結果編號順序。

表4 篩選菌株分子生物學鑒定結果

3.3 奶豆腐制作結果分析

3.3.1 奶豆腐感官品質評價

將篩選得到的3株乳酸菌按照1∶1∶1的比例混合制成復合菌劑加入到市售純牛奶中進行自然發酵，并將發酵凝乳用于奶豆腐的制作。重復制作6個批次后，所制奶豆腐產品得率與感官評定如表5。由結果顯示，經菌劑發酵制作的奶豆腐感觀評分平均值在83.8分，整體感觀評分較好，質地光滑，組織較細膩，但融水狀態略差，受熱易分散。制得奶豆腐平均得率為13.7%±0.81%，與傳統奶豆腐加工生產得率(一般在10%左右)相比提高了37%。而據文獻報道，王曉宇等[20]利用篩選所得菌種進行工業化生產奶豆腐時，通過對菌種添加量、發酵溫度、排乳清溫度以及攪和溫度進行工藝優化后，奶豆腐出成率可達8.31%。由此可知，本實驗所篩選的菌種進行奶豆腐制作時，產品得率顯著提高，但產品整體感觀評分略差，融水狀態渾濁，受熱易分散。這可能是由于在奶豆腐制作過程中上層乳脂析出較少，使得最終產品中含脂率偏高，這也由表6理化檢測結果中得到驗證，同時也符合王曉宇對含脂率偏低(<1.4%)的原料乳適合奶豆腐工業化生產的推斷。

表5 奶豆腐產品得率與感官評分

表6 奶豆腐理化檢測指標

3.3.2 奶豆腐理化品質評價

奶豆腐的理化檢測指標數據見表6，可知水分平均含量為41.6%±3.7%，符合地方標準DBS15/001.3-2017要求(水分≤53%)[21]；蛋白質平均含量為21.9%±1.5%，略低于地方標準DBS15/001.3-2017要求蛋白質含量≥26%；脂肪平均含量為27.5%±2.1%，雖然此次重新修訂的地標中未限定具體脂肪含量，但整體含量遠高于原地方標準DBS15/001.3-2011要求≥10%，同時也高于文獻報道奶豆腐脂肪含量在8%～25%。所制得奶豆腐理化檢測顯示蛋白質含量與地標要求的奶豆腐指標相比偏低，而脂肪含量相對偏高，這可能與奶豆腐制作工藝中的脫脂程度和晾曬脫水分程度有關[22]。如，奶豆腐根據水分含量可分為濕、半干、干3種產品類型，而依據產品類型的不同，奶豆腐的水分、蛋白質，脂肪及灰分等營養成分指標也有所不同[23]。由于本實驗所使用的復合菌劑在制作奶豆腐時會出現脂肪上浮較少，使得脫脂程度降低，最終所得產品脂肪含量較高。因此，推斷該復合菌劑可用于生產高脂型奶豆腐，而脂肪含量增加，不僅使產品的營養價值增高，更賦予了其獨特的風味。

4 結論與討論

本實驗通過對分離于錫林郭勒傳統奶酪中的51株乳酸菌進行優良發酵性能的篩選，以37℃的條件下，發酵8h，酸度>80oT進行初篩，并以最終常溫凝乳狀態和加熱凝乳狀態等綜合因素作為篩選的標準進行復篩。共篩出了3株發酵時間短、凝乳組織狀態好、具有良好感官風味的乳酸菌。并對其進行了序列測序以及同源比對，最終確定3株菌株皆為乳酸乳球菌(L.lactis)，且同源相似性均為100%。雖然所篩選得到菌株均為乳酸乳球菌，但菌株的發酵性能并不完全相同，這可能是由于所篩選的菌株隸屬于乳酸乳球菌的不同亞種，而本實驗利用細菌通用引物只能將菌種鑒定到種的水平，對于亞種還需進一步鑒定。

將篩選得到的3株優良發酵性能乳酸菌進行1∶1∶1混合制成復合菌劑，以此復合菌劑制作奶豆腐，所得產品整體感觀評分較好，平均得率與傳統奶豆腐加工生產得率相比提高了37%。所得奶豆腐整體脂肪含量相對偏高，由此推斷，本實驗所使用的復合菌劑在制作奶豆腐時會使脫脂程度降低，并利用所篩選菌株發酵生產奶豆腐所得產品得率與理化指標均有較好改進，可為錫林郭勒奶酪發酵劑的研發以及新型高脂型奶豆腐產品的生產提供一定的科學依據。