果蠅永久制片開發及在遺傳學實驗教學中的應用

王洪預 劉佳欣 宋慧寧 陳浩源 趙占名 趙磊 劉宏魁 李秋祝

(吉林大學植物科學學院，吉林 長春 130062)

遺傳學是當今生命科學中發展最快、最活躍的學科之一，是生物學科各專業的重要基礎課[1]。溫帶生物黑腹果蠅(Drosophila melanogaster，2n=8)作為遺傳學研究中的模式生物，在遺傳、發育、衰老、腫瘤、神經退行性疾病等領域的研究中具有重要地位。以果蠅為材料的遺傳學實驗，可覆蓋分離規律、自由組合規律和獨立分配規律，是中學及高校本科生物學實驗教學中重要的實驗對象[2]。“孟德爾的豌豆雜交實驗”是人教版生物學教材必修內容[3]，也是高校遺傳學實驗教學的重點和難點。用豌豆作為材料進行實驗受制于實驗條件和時間，學生無法親手操作完成。因此，在遺傳學3大規律的驗證性實驗中，果蠅一直都是首選實驗材料[4]。果蠅作為經典的遺傳學實驗材料有其突出優點，主要表現在5個方面，生長迅速，世代周期短；繁殖力強，后代數量大，便于統計分析；個體小，飼養管理方便；變異類型多，易于觀察和雜交組合；有巨大型染色體，且數目較少(2n=8)，便于觀察研究[5]。對果蠅進行性狀觀察和性別鑒定是果蠅實驗重要內容，也是進行遺傳規律實驗前必須熟練掌握的技能。初學者往往因實驗經驗不足，果蠅處于麻醉狀態時間短，很難在有限的時間內完成操作，及時挑選出所需的處女蠅。一旦出現觀察未完成但果蠅已經蘇醒的情況，不得不進行反復麻醉，很容易造成果蠅死亡。此外，乙醚已被列為國家二級易制毒管控試劑[6]，具有揮發性且易燃易爆，同時對實驗操作者身體也可能會造成一定的傷害。果蠅的低溫與CO2麻醉技術均安全可靠，效果也較好，但對實驗設備及條件要求較高，很多裝置都是各教學科研單位自制，沒有批量生產，不能在市場上直接購得[7]。

制作果蠅永久制片，可以使學生有充分時間詳細觀察果蠅的性狀，并準確進行性別鑒定，對于初學者而言，是簡單有效的解決辦法。果蠅性別鑒定與性狀觀察需要確認多個部位細節，所以制片應盡可能地保持果蠅生活姿態，不破壞其身體結構。本團隊根據教學實際需要，摸索總結出一套操作簡單的果蠅永久制片制作方法，且無需增加實驗室投入。所得制片可以在4℃冰箱中長期保存，在室溫下正常反復使用，目前已經在相關實驗教學中得到了成功應用。

1 果蠅永久制片的制作

1.1 實驗備品

解剖針、鑷子、培養皿、膠頭滴管、接種針(或小毛筆)、小藥匙、載玻片、蓋玻片、麻醉瓶、白紙板、標簽紙、體視顯微鏡，如圖1。

圖1 實驗備品

1.2 實驗試劑

乙醚、70%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯、樹膠、蒸餾水，如圖2。

圖2 實驗試劑

1.3 制作步驟

1.3.1 選材

選取符合性狀要求的果蠅，乙醚麻醉后置于載玻片。以活體果蠅乙醚麻醉后直接進行制片為最佳；實驗過程中淘汰的果蠅，麻醉后迅速放入70%乙醇中，在15d內用來制片效果也較好；死去時間過長的果蠅因身體卷曲或失水，不宜用于制片。

圖3 死后30d制片 圖4 死后15d制片 圖5 麻醉后立即制片

1.3.2 清洗

將果蠅放于載玻片上，加入1滴純凈水，洗去體表的螨蟲、粘著的培養基和灰塵等，要小心操作，注意不要損傷果蠅的翅及身體。清洗和移動果蠅時，可用小藥匙配合接種針進行操作，須單只進行。接觸液體后，不能再用小毛筆移動果蠅。

1.3.3 透明

將清洗后的果蠅移入盛有二甲苯培養皿中，透明約5min。此過程可增加標本對比度，觀察時效果更佳。

1.3.4 脫水

將透明后的果蠅分別放入盛有濃度為70%、95%、100%乙醇的培養皿中，各浸泡3min，以脫去果蠅表面水分，確保果蠅標本不會因后期脫水而導致變形，影響觀察效果。

1.3.5 整姿

用解剖針在潔凈載玻片上滴1小滴樹膠，樹膠量不宜過多，多余樹膠在蓋片外會影響制片的美觀，可用二甲苯去除。將脫水后的果蠅放入樹膠中，利用接種針等工具將果蠅調整到理想觀察姿態。按觀察目的不同，可將翅、復眼和前足等部位調整至最佳角度，如性狀觀察主要區分長翅與小翅、紅眼與白眼以及體色的不同；性別鑒定主要觀察性梳的有無、腹部條紋數和外生殖器等。此過程中，如樹膠出現起皺現象，可用解剖針沾取少量二甲苯于樹膠上，以保證操作順利進行。

圖6 白眼小翅雄蠅 圖7 紅眼小翅雄蠅 圖8 紅眼長翅雌蠅

1.3.6 蓋片

整姿完成后，迅速用鑷子小心蓋上蓋玻片，再利用解剖針輕輕按壓，使樹膠在蓋片下均勻分布，并排出氣泡，蓋片不能用力按壓，否則會導致果蠅身體破裂。蓋片四周如有空隙，可再補充少許樹膠封好。蓋玻片可稍大一些，這樣能夠容納較多樹膠，使果蠅在長時間封存中不產生變形或氧化。根據經驗，使用14mm圓形蓋玻片即可達到較好效果。

1.3.7 標注

標注應寫明果蠅性狀和性別，注明制作日期和制作人。因果蠅體型較小，所以全部操作過程均需在體視顯微鏡下進行，但放大倍數不宜過高，體視顯微鏡(廈門Motic)放大20倍即可滿足要求。放大倍數過高，難以精確控制果蠅位置，會影響實驗效果。

圖9 學生完成的制片 圖10 實驗室現有制片

2 果蠅永久制片在教學中的應用

實驗室所用果蠅品系，最佳保存條件為18℃，60%濕度，每28d左右需更換1次培養基[8]。一般在教學使用前30d，需進行擴繁，并于25℃條件下保存，供學生觀察與實驗操作。果蠅永久制片的開發，使以下實驗不受時間和條件限制，學生隨時可以開展實驗。

2.1 果蠅形態與性狀觀察

果蠅形態與性狀觀察一直是使用果蠅第一課。野生型果蠅為紅眼、長翅、直剛毛、灰身，對應各種突變型分別為白眼、小翅、卷剛毛、黑檀體等。對果蠅各種形態特征的觀察是認識并利用果蠅第一步。但無論采用低溫麻醉還是乙醚麻醉，果蠅都會在較短時間內恢復行動能力，要求觀察者快速準確完成操作[9]。學生做為初學者，往往不能在有限時間內掌握實驗要求內容。果蠅永久制片在4℃冰箱內可長期保存，反復使用，而且對觀察者無技術上要求，可以隨時進行觀察，學生有充分時間準確區分各種性狀，無需擔心果蠅蘇醒而中斷觀察。

2.2 果蠅的性別鑒定

以果蠅為實驗材料的遺傳規律驗證實驗，如自由組合規律實驗和伴性遺傳實驗，都需要準確選用處女蠅，這是實驗成敗的關鍵。剛羽化的果蠅體色較淺，身體未完成展開，因此采用觀察腹部條紋和根據體型大小的差別進行鑒定并不可靠。在處女蠅的選取中，分辨雌雄果蠅最準確方法就是觀察性梳的有無[10]，而初學者在有限時間內很難準確判斷性梳的有無，從而導致挑選處女蠅失誤，造成實驗失敗。利用果蠅永久制片，可對性梳的位置、形態有準確的認知，并結合體型、腹部末端條紋等形態特征對果蠅的性別做出判斷，這樣在處女蠅選取時就會做到迅速準確。

3 結語

生物科學是建立在實驗基礎上的學科[11]，實驗是人才培養中不可忽視的教學環節，通過實驗操作技能的訓練，使學生能將理論知識與實踐操作相結合[12]。在吉林大學植物科學學院本科遺傳學教學實踐中，安排2學時實驗課，利用果蠅永久制片進行性狀觀察與性別鑒定，使學生輕松、迅速和準確地掌握了實驗要求內容，取得了很好的教學效果，也為伴性遺傳和遺傳距離測定實驗中，利用活體果蠅進行操作打下良好基礎；果蠅永久制片也已經在黑龍江省海林林業局第一中學的生物實驗課上得到了應用，受到師生廣泛好評。