仿生再礦化提高樹脂-牙本質粘接界面耐久性的研究進展

侯妍妍，陳 歡，馮杉杉，金毅夫，丁景瑜，朱 松

研究表明復合樹脂粘接修復體的壽命為5～7 年[1-2]，并且約70%的修復體需要再次干預治療[2]。復合樹脂粘接修復過程中，牙本質-復合樹脂粘接界面的質量尤為重要，牙本質-復合樹脂粘接界面的耐久性比牙釉質-復合樹脂粘接界面低，這主要與纖維之間的水分難以置換有關。牙本質的礦化程度對粘接劑的粘接強度至關重要[3]。牙本質脫礦后，磷灰石晶格中的礦物質離子缺失，導致膠原(主要是Ⅰ型膠原纖維)暴露，內源性基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)[4]及半胱氨酸組織蛋白酶(cysteine cathepsin)會降解膠原。脫礦區域的再礦化有助于恢復脫礦牙本質的多級結構和機械性能，與此同時可以置換纖維間水分，是提高樹脂-牙本質粘接界面耐久性的一種途徑[5]。

1 牙本質礦化機制

牙本質是一種多孔的骨樣基質。按質量比計算，它由70%的羥基磷灰石、20%的有機基質和10%的水組成[6]。有機基質中，大約90%是Ⅰ型膠原；其余10%的基質包括糖蛋白和非膠原蛋白(non-collagenous proteins，NCPs)。研究表明，Ⅰ型膠原纖維本身并不能誘導磷灰石晶體的成核和生長[7]，而對鈣離子和膠原纖維有高度親和力的NCPs可作為礦物沉積的成核劑和抑制劑，誘導和調節牙本質生物礦化[8]。牙本質生物礦化是NCPs作為礦化模板物，Ⅰ型膠原作為支架，羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)在牙本質膠原纖維間隙和牙本質膠原纖維表面沉積的過程[9]。但脫礦的牙本質無法自發形成生理性牙本質，研究者對此提出多種策略。

1.1 “自上而下”的再礦化

在部分脫礦的齲壞牙本質中，殘留在膠原基質纖維內的磷灰石微晶是鈣磷離子成核位點，隨后晶體外延生長，稱為“自上而下”的再礦化[10-11]。此種再礦化主要在脫礦組織周圍存在大量的氟化物和含有亞穩態鈣磷離子的底物[12],并依賴于微晶的外延性生長，屬于異相成核[11]，其晶格的取向是由晶種的晶格決定。現有的大多數再礦化制劑所致的再礦化都是“自上而下”的再礦化，沒有NCPs的參與[12]，并不會發生自發性礦物成核以及基質內礦物沉積[13]，礦物沉積于膠原纖維表面形成纖維外礦化，其結構和機械性能等方面與生物礦化牙本質存在很大差異。

1.2 “自下而上”的再礦化

為了誘導磷灰石在完全脫礦牙本質的膠原纖維內沉積，有人提出了基于亞穩態納米前驅體并輔以NCPs仿生類似物的“自下而上”再礦化策略[14]。“自下而上”的再礦化策略是基于非經典結晶理論，通過無定形磷酸鈣(amorphous calcium phosphate，ACP)納米前驅體的定向附著實現的[15]。這就要求必須同時存在穩定礦物前驅體功能類似物(避免過早的纖維外結晶)和模板功能類似物(引導磷灰石在膠原基質中以定向和多級的有序方式生長)。有研究者嘗試用多種NCPs仿生類似物模擬牙本質NCPs(牙本質基質蛋白Ⅰ(dental matrix protein 1，DMP-1)，牙本質磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)和牙本質涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP))的成核抑制功能[16]，防止ACP過早結晶，控制其尺寸和保持流動性，再現脫礦膠原蛋白基質中磷灰石沉積物的結構層次。此種再礦化方式在一定程度上模擬了牙本質生物礦化的過程，可以較好地解決牙本質脫礦問題。

2 仿生類似物研究進展

“自下而上”的再礦化需要仿生類似物的誘導，即需要良好的成核模板。研究已經發現十多種仿生類似物可促進牙本質再礦化[17]。

2.1 誘導纖維內礦化的聚合物

NCPs是牙齒發育過程中由成牙本質細胞在多種生長因子和信號分子調控下分泌的,在牙本質的生物礦化過程中， DMP-1負責調控晶體成核、晶體生長和礦物質的形成[18]。而牙本質的仿生再礦化可能需要兩種不同的牙本質類似磷蛋白：一種為螯合劑，可控制ACP的聚集；一種為磷蛋白替代物，可促進HA在膠原的特定部位沉積，從而使礦物前體在特定部位形成核[19]。多陰離子電解質被用來模擬NCPs的負電荷特性，聚天冬氨酸、聚谷氨酸和聚丙烯酸(poly acrylic acid, PAA)常被用作NCPs的類似物單獨使用，或與其他模擬磷酸化NCPs的分子(聚乙烯基膦酸(poly vinyphosphonic acid, PVPA)、三偏磷酸鈉(sodiumtrimetaphosphate，STMP)、三聚磷酸鈉或多磷酸化肽)結合使用，以誘導纖維內礦化。前者作為穩定功能類似物模擬了DMP-1的ACP結合位點，將ACP 穩定在納米前驅體狀態，防止流體ACP聚集成更大的顆粒。而后者作為模板功能類似物，引導ACP 納米前驅體結合到牙本質膠原上并在特定位點成核生長，形成與生物礦化牙本質形態結構相似的“自下而上”的再礦化牙本質。Lin等[20]將人牙本質樣本浸泡在含有PAA和PVPA的溶液中并與Potland cement接觸，對照組浸泡模擬體液(simulated body fluid，SBF)中，結果顯示實驗組有磷灰石晶體沉積，即發生了再礦化。Abuna等[21]將PAA和STMP加入底涂劑中，混合層的納米動力學機械性能有所提高；相反，在沒有仿生類似物的情況下，樣品顯示混合層內樹脂成分稀疏，富水區域增加，機械性能顯著下降等特征。此外有研究證明，PVPA作為牙本質基質蛋白類似物,可以有效地抑制MMPs的活性[22]。可以誘導纖維內礦化的聚合物研究廣泛、種類繁多且細胞毒性較小，具有良好的應用前景。

2.2 促礦化仿生肽

由于天然的NCPs含量較少，來源有限，且價格昂貴，存在免疫源性等問題，而模仿天然蛋白質功能的相對較短的肽序列合成成本較低，可以大量制備，因此有些學者轉而進行含有相同功能的仿生肽的制備。

2.2.1 促礦化仿生多肽 多肽是組成蛋白質的二級結構單位；仿生多肽，是指在體外合成人體蛋白發揮功能的關鍵性片段序列，以發揮其特定生理功能。天冬氨酸-絲氨酸-絲氨酸(DSS)是DPP中的基本重復單元，此序列可以促進HA形成。研究表明，帶有多個DSS重復序列的DPP衍生肽可重現其功能[23]。Liang等[24]將 8DSS多肽涂覆在經酸蝕脫礦的牙本質樣本表面并置于SBF中，3周后脫礦牙本質發生再礦化，證明了8DSS可以與膠原基質良好結合并有效地誘導礦物再生。8DSS作為穩定功能類似物，其帶負電荷的氨基酸基團對鈣磷化物具有高度的親和力，并且可以穩定 ACP在納米前驅體狀態，繼而誘導HA成核生長。肽的尺寸小很容易擴散進入牙本質小管，從而促進磷灰石動態結晶，堵塞開放的牙本質小管[25]，這在解決牙本質過敏方面具有重要的臨床意義。

2.2.2 促礦化仿生寡肽 寡肽是由少量的氨基酸通過肽鍵結合而成的分子量較小的肽類化合物，與生物大分子相比，由于其較低的合成成本和分子結構相對容易調控的特點備受關注[26]。Wang等[27]制造了一種模仿天然NCPs的新型兩親性寡肽，研究其在纖維內礦化中的有效性。結果表明，自組裝的寡肽可以通過靜電引力及氫鍵作用吸引鈣離子，誘導形成非晶態前體,并結合至膠原纖維表面，實現了纖維內礦化，另外，自組裝寡肽誘導了牙本質膠原的再礦化。Cao等[28]制造一種模擬DMP1的寡肽，將酸蝕的人牙本質切片用寡肽包被，浸入含氯化鈣和磷酸氫鈉的溶液中，從而引發羥基磷灰石的成核和生長。通過這種寡肽促進牙本質的仿生礦化是臨床治療牙本質過敏的一種潛在治療技術。

2.3 聚酰胺-胺樹枝狀聚合物(poly(amidoamine)，PAMAM)

PAMAM分子內部存在空間，分子結構精確，外部帶有大量官能團，表面基團易于改性，具有良好的生物活性等優點[29]，是目前研究最為廣泛的樹枝狀聚合物之一。Liang等[30]在脫礦牙本質表面構造 PAMAM 涂層，以ACP納米顆粒為鈣、磷離子來源，實現了牙本質的再礦化。隨著研究的不斷深入，改性后的PAMAM具有的多功能性也引起了學者關注。Gao等[31]研究了四代PAMAM的生物礦化作用，氟化鈉(NaF)作為陽性對照，將兩個樣本進行酸蝕后，測量了牙本質的滲透性及其表面沉積物。結果表明，PAMAM和NaF分別將牙本質通透性降低了25.1%和20.7%。在牙本質表面沉積物的測定中PAMAM最初比NaF慢，但在28 d后達到了同一水平。此外，PAMAM不僅可在牙本質表面礦化，而且可以在更深水平誘導生物礦化。首先，PAMAM可以通過靜電相互作用和尺寸排阻效應，與膠原纖維結合并保留在纖維內；其次，PAMAM作為模板功能類似物能夠成為鈣離子結合位點，吸引鈣離子成核結晶進行再礦化，PAMAM作為穩定功能類似物，可以穩定ACP于納米相，控制ACP向HA晶體的相變速度。研究表明PAMAM具有生物酶活性抑制作用[32]，對變異鏈球菌有抗菌作用[33]。值得注意的是，PAMAM存在細胞毒性，應避免直接接觸[34]。通過添加不同的小分子賦予PAMAM不同功能，可以使其在包括生物醫學的許多領域中有不同的應用。

2.4 磷酸化殼聚糖(phosphorylated chitosan，P-chi)

殼聚糖衍生于甲殼素，是由D-氨基葡萄糖重復形成的天然高分子多糖，具有無毒、生物相容性好、易生物降解、抗菌活性及機體環境友好等特性[35]。Xu等[36]將P-chi共價固定在膠原蛋白表面，隨后將部分脫礦的人牙本質切片放入再礦化液中，將氟化物的再礦化作為對照組。實驗結果表明，當部分脫礦牙本質表面缺少殘留的晶體時，氟化物對牙本質再礦化的作用受到限制，而P-chi的共價固定可顯著促進牙本質的表面再礦化。P-chi作為穩定功能類似物，其磷酸基團能夠螯合鈣離子至表面，從而表面形成正電荷與磷酸根離子結合，在溶液中誘導液-液相分離，保持ACP尺寸大小及非晶狀態。殼聚糖來源廣、易于提取，通過進行化學結構修飾可以提高其力學、化學、生物學特性，具有諸多優點。

3 小結與展望

仿生再礦化策略在提高樹脂-牙本質粘接界面耐久性方面具有較大潛力，但迄今為止該策略仍處于概念驗證階段。首先，誘導脫礦牙本質再礦化需要較長的一段時間；其次，當仿生類似物從底涂劑中持續釋出后，其機械強度會隨之不斷下降，減少了材料的使用壽命。此外絕大多數的再礦化實驗均發生在液相環境中。因此仿生類似物促進牙本質再礦化策略在向臨床轉化過程中所面臨的關鍵問題是，如何在粘接劑固化后緩慢釋放礦化所需有效成分的同時，保持粘接界面長時間有效的藥物濃度，以及材料機械性能的穩定。針對這些問題，我們是否可以將仿生類似物進行改性(如賦予其光固化特點)，使其與粘接劑在光固化過程中發生穩定的化學結合，實現藥物釋放的長效性的同時保持粘接劑性能的穩定。粘接劑在隨著仿生礦化領域不斷開發新的仿生材料以及研究的深入，脫礦牙本質仿生再礦化會逐步走向成熟。