膝關節骨關節炎相關炎癥及軟骨代謝標志物的表達與臨床意義

黃遠 劉日光 張沕 董亮宏 楊嘉飛 石豪 王愛民 楊正杰 李光第*

1.銅仁市人民醫院骨科，貴州 銅仁 554300 2.貴州醫科大學附屬醫院骨科，貴州 貴陽 550004 3.黔東南州人民醫院骨科，貴州 凱里 556000

膝關節骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是常見的慢性骨關節疾病，因現有診斷方法的局限性，臨床上很難發現最早期KOA，當患者因各種不適就診時，膝關節已經發生了不可逆性損傷。因此，深入研究KOA發病機制，尋找到有效的治療靶點，早期診斷已成為醫學上亟待解決的問題。KOA的發病有一個“沉默期”，在此期間患者沒有任何臨床癥狀，影像學檢查也沒有異常，但關節組織已經發生廣泛的代謝改變[1-2]。生物標志物(Biomarker，BM)是指能客觀測量并且可以評估正常生理代謝過程、病理變化以及治療效果的生化指標[3-4]。在影像學改變之前，血液、尿液及關節液等體液組織中的BM能夠動態地反映關節組織代謝狀況，評估關節組織病變程度，已經得到國內外學者的認可[5-7]。監測體液BM的變化情況，及時發現早期病變并采取有效治療措施，這將對KOA早期診斷、病程監測以及療效評估起到積極的指導作用[8-9]。KOA的病理生理變化，尤其是局部炎癥反應及關節軟骨的破壞是骨科領域研究的熱點，有研究者提出單一生物標志物的檢測靈敏度相對較差，若能將幾項標志物聯合檢測，可更加準確地反映病變情況[10-11]。

本研究以KOA患者為研究對象，采集血清、尿液、關節液以及關節軟骨標本，聯合檢測COMP、MMP-13、Cbf-β的表達情況。本研究采取自愿參與的原則且通過貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會審批，批件號：2018倫審(15)號。并在中國臨床試驗注冊中心(Chinese clinical trial registry，ChiCTR)注冊登記，注冊號：ChiCTR1800017066。

1 材料與方法

1.1 體液部分

1.1.1一般資料：納入2018年6月至2019年1月貴州醫科大學附屬醫院骨關節外科收治，行人工全膝關節置換的KOA患者22例為試驗組。納入同期行關節腔注射治療的KOA患者22例為對照組。納入健康志愿者18例為健康對照組。

1.1.2納入排除標準：納入標準：①符合KOA的診斷標準[12-13]；②既往無膝關節感染及手術外傷史；③既往無關節穿刺及注射治療史；④無激素、免疫抑制劑等藥物服用史；⑤沒有嚴重的系統性疾病且肝、腎功能無明顯異常。排除標準：①腫瘤、結核等慢性消耗性疾病；②痛風、類風濕性關節炎等其他類型骨關節疾病；③先天性因素所致膝關節畸形及功能障礙；④患有精神類疾病不能配合研究者；⑤不同意參與試驗及未簽署知情同意書的患者。

1.1.3實驗方法：血清、尿液、關節液標本采集后分裝于1.5 mL EP管，凍存于-80 ℃冷庫。采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定標本中COMP、MMP-13、Cbf-β的表達情況。COMP、MMP-13試劑盒購于武漢華美公司，Cbf-β試劑盒購于上海酶聯生物科技有限公司。具體操作步驟如下：①標準品加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品 50 μL；②加樣：分別設空白孔和待測樣品孔。在待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品 10 μL；③加酶：每孔加入酶標試劑 100 μL，空白孔除外；④溫育60 min；⑤配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用；⑥洗滌：每孔加滿洗滌液，靜置 30 s后棄去，如此重復5次；⑦顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL顯色15 min；⑧終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(藍色立轉黃色)；⑨測定：以空白孔調零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。

1.2 軟骨組織部分

1.2.1一般資料：納入2018年6月至2019年1月貴州醫科大學附屬醫院骨關節科收治，行人工全膝關節置換術的KOA患者22例為試驗組，納入同期外傷急診截肢患者8例為對照組。納入排除標準同第一部分，正常對照組軟骨取自年齡大于18歲急診截肢患者，排除KOA或關節慢性疼痛病史，既往無膝關節外傷、感染、手術等情況。

1.2.2試驗方法：采集膝關節軟骨組織標本，觀察其大體結構并做好記錄，取脛骨平臺全層軟骨，成塊狀取下，置于5 mL EP管，4%多聚甲醛浸泡固定。另一部分成片狀切下，置于5 mL EP管，-80 ℃冷庫凍存。通過番紅O固綠染色觀察軟骨組織病變情況，應用免疫組化法檢測軟骨組織Ⅱ型膠原表達情況。應用免疫印跡蛋白定量法(Western Blot)檢測軟骨組織COMP、MMP13、Cbf-β蛋白的表達情況。

1.2.3主要實驗試劑與儀器：番紅-固綠染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，即用型免疫組化二抗試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)，COMP、MMP-13、Cbf-β抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，β-actin抗體(Abclonal公司)，EDTA脫鈣液(北京雷根生物技術有限公司)，微量移液器(Eppendorf公司)，冷凍離心機(Thermo公司)，漩渦振蕩儀(Labnet公司)，電泳儀(Bio-rad公司)、垂直電泳槽(Bio-rad公司)、化學發光成像系統(Bio-rad公司)。

1.2.4實驗步驟：(1)番紅O固綠染色：將固定的軟骨組織塊EDTA脫鈣液脫鈣后，石蠟包埋、切片，入固綠染色液內浸染5 min弱酸溶液洗滌后，入 Safranin O stain 內浸染 5 min，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。(2)Ⅱ型膠原免疫組化：將固定的軟骨組織行免疫組織化學染色。具體操作步驟如下：①石蠟切片脫蠟；②抗原修復：組織切片置于修復盒中于微波爐內進行抗原修復；③阻斷內源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液孵育25 min；④BSA或者血清封閉：用組化筆在組織周圍畫圈，在圈內滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，封閉30 min；⑤孵育一抗，再使用二抗；⑥DAB顯色：滴加DAB顯色液，陽性為棕黃色；⑦復染細胞核；⑧脫水封片；⑨顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。采用Image Pro-Plus 6.0軟件，分析每張片子陽性細胞的累計光密度值(IOD)。(3)蛋白水平Western Blot 檢測：將凍存的軟骨組織在液氮中研磨后提取蛋白，BCA 法測定各組蛋白濃度。根據測定的蛋白含量作為參照，每個膠孔加入等量蛋白，再以β-actin為參照驗證蛋白含量。重復實驗調整蛋白上樣量使其一致，使用統一蛋白上樣量進行SDS-PAGE，每個蛋白上樣40 μg進行SDS-PAGE，轉膜，孵育一抗，再使用二抗，以Bio-Rad化學發光成像系統顯色，結果使用Image J 2X軟件對Western-Blot條帶進行半定量，分析其讀數，最后以β-actin作為內參計算樣本的相對表達量。

1.3 統計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行統計分析，計量資料比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，計數資料比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體液部分試驗結果

2.1.1一般資料比較：見表1。

表1 體液部分各組基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data of body fluid between each group

2.1.2血清標本檢測結果：三組受試者血清中均檢測到COMP、MMP-13、Cbf-β的表達，各因子在健康對照組、試驗對照組、試驗組間的表達均逐漸增高，經單因素方差分析，COMP、MMP-13、Cbf-β在試驗組、試驗對照組以及健康對照組血清的表達差異有統計學意義(P=0.001、0.001、0.001)。見圖1。

圖1 各組血清標本BM檢測結果Fig.1 Detection results of BM in serum samples of each group注：*P<0.05，**P<0.01。

2.1.3尿液檢測結果：三組受試者尿液中均檢測到COMP、MMP-13的表達，各因子在健康對照組、試驗對照組、試驗組間的表達均逐漸增高，經單因素方差分析，COMP、MMP-13在試驗組、試驗對照組以及健康對照組尿液的表達差異有統計學意義(P=0.001、0.001)。見圖2。

圖2 各組尿液標本BM檢測結果Fig.2 Detection results of BM in urine samples of each group注：*P<0.05，**P<0.01。

2.1.4關節液檢測結果：三組受試者關節液中均檢測到COMP、MMP-13、Cbf-β的表達，各因子在健康對照組、試驗對照組、試驗組間的表達逐漸增高，經單因素方差分析，COMP、MMP-13、Cbf-β在試驗組、試驗對照組以及健康對照組關節液的表達差異有統計學意義(P=0.001、0.001、0.001)。見圖3。

圖3 各組關節液標本BM檢測結果Fig.3 Detection results of BM in synovial fluid samples of each group注：*P<0.05，**P<0.01。

2.2 軟骨組織試驗結果

2.2.1一般資料比較：見表2。

表2 軟骨組織各組基線資料比較

2.2.2番紅O固綠染色結果：番紅O固綠染色可見對照組軟骨基質紅染均勻，軟骨下骨呈綠色，軟骨與軟骨下骨界限清楚，結構整齊。實驗組軟骨結構層次紊亂，軟骨基質染色較淡，并且紅染范圍小，提示試驗組病變膝關節軟骨基質破壞、減少；而綠染范圍大，提示試驗組膝關節軟骨病變較重。見圖4。

圖4 軟骨組織番紅O染色結果Fig.4 Results of Safranin O fast green staining in the cartilage

2.2.3免疫組化結果：試驗組軟骨組織Ⅱ型膠原蛋白的表達較對照低，經獨立樣本t檢驗，Ⅱ型膠原蛋白在試驗組與對照組的表達差異有統計學意義(P=0.001)。見圖5。

圖5 軟骨組織Ⅱ型膠原表達情況Fig.5 Expression of type II collagen in the cartilage注：*P<0.05，**P<0.01。

2.2.4Western Blot檢測結果：試驗組軟骨組織COMP、MMP-13、Cbf-β的表達均高于對照組，經獨立樣本t檢驗，COMP、MMP-13、Cbf-β在試驗組與對照組的表達差異有統計學意義(P=0.001、0.002、0.002)。見圖6。

圖6 軟骨組織BM表達情況Fig.6 Expression of BM in the cartilage注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

血液、尿液及關節液內生物標志物的變化可反映KOA的病變嚴重程度，預測疾病的進展，近年來引起廣大醫學研究人員的重視[14-15]。致病因素的持續存在使軟骨代謝發生改變時，軟骨基質合成與分解代謝的動態平衡被打破，其代謝過程中的小分子產物是生物標志物最豐富的來源[16]。

血清COMP可作為OA病變的特異性生物標志物，輔助OA的早期診斷，并且在預測疾病快速進展的危險性方面有一定的參考價值[17-18]。Kluzek等[19]研究表明，血清COMP可以預測KOA的發生發展，并且獨立于年齡和BMI等發病高危因素。MMP-13是最有效的Ⅱ型膠原降解酶，可有效降解軟骨基質，促進軟骨病變的進展，有研究表明MMP-13在KOA患者血清高表達，其表達含量與膝關節病變嚴重程度呈正相關[20-21]。也有研究報道在KOA患者血清中同時檢測到COMP與MMP-13的高表達，與K-L分級、WOMAC評分呈正相關，提示血清COMP和MMP-13聯合測定可動態監測KOA膝關節病變的進展，在早期診斷、病情評估等方面有一定的參考意義[22]。有文獻指出Cbf-β可能通過增強Runx2與DNA結合及轉錄活化也參與到骨性關節炎的病變調控[23-24]，本研究在KOA患者及健康志愿者血清中檢測到了Cbf-β的表達，KOA患者明顯高于健康志愿者，同COMP與MMP-13一致，在病變較重的試驗組高于病變較輕的試驗對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。提示血清Cbf-β可能是KOA潛在的生物標志物，對于KOA的早期診斷及病情評估有一定的參考價值，聯合檢測血清COMP、MMP-13、Cbf-β的表達，可能更準確地反映KOA患者膝關節軟骨的病變進展程度。

既往對于KOA相關生物標志物的研究多集中在血清及關節液，而關于尿液生物標志物的研究較少，因其獲取簡單并且無創采集的特點，使得尿液生物標志物研究越來越受到重視。有學者指出尿液蛋白質組學的研究有助于更好地了解身體的動態變化并識別潛在的疾病特異性生物標志物[25-26]，其代謝產物的改變可以反映組織器官的代謝狀況[27]。有文獻指出COMP及CTX-II在KOA患者尿液中高表達，其含量隨K-L分級的增加而逐漸升高，可作為KOA診斷及嚴重程度評估的參考標志物[29]。本研究在KOA患者尿液中檢測到COMP、MMP-13的高表達，KOA患者明顯高于健康志愿者，并且試驗組表達高于試驗對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。提示尿液COMP、MMP-13可能在KOA的早期診斷，病情評估具有重要的參考意義。

關節病損后組織結構以及細胞代謝的變化可以通過關節液的變化來體現[30]。KOA軟骨病變后相關代謝產物直接釋放于關節液，關節液內代謝相關標志物的變化可以靈敏地反映關節軟骨的病理變化[31]。研究表明KOA患者關節液內COMP的表達與病變程度以及疾病進展有一定的相關性，可作為OA的診斷性標志物[32]。也有文獻表明在KOA患者關節液內檢測到COMP的高表達，表達水平與關節損傷的影像學表現呈正相關，提示關節液COMP對KOA軟骨破壞的監測有一定的參考價值[33-34]。MMP-13作為軟骨基質有效的降解酶，在膝關節病變過程中起到了關鍵作用，?zler等[34]研究表明，重度KOA患者關節液內MMP-13的表達與WOMAC評分顯著相關。本研究在試驗組、試驗對照組、健康對照組關節液中均檢測到了COMP、MMP-13、Cbf-β的表達，KOA患者顯著高于健康志愿者，并且試驗組高于試驗對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示關節液內COMP、MMP-13、Cbf-β的表達含量可能與KOA病變嚴重程度呈正相關性，可反映病變的嚴重程度。

軟骨破壞是KOA的特征性病變，本研究在試驗組及對照組軟骨組織標本均檢測到了COMP、MMP-13、Cbf-β的表達，試驗組顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示COMP、MMP-13、Cbf-β可能參與了KOA病變進程，進一步驗證了三者在血清、尿液、關節液內表達對疾病診斷、病情評估的參考意義。

綜上所述，聯合檢測COMP、MMP-13、Cbf-β在血清、尿液、關節液及關節軟骨的表達，有助于KOA的早期診斷，也可為病變嚴重程度的評估提供參考依據。但是在軟骨部分的試驗結果中，兩組在年齡因素比較中差異有統計學意義，分析原因如下，受疾病好發人群的年齡限制，在臨床中行人工全膝關節置換術的KOA患者和同期外傷急診截肢患者相比年齡偏大，盡管正常對照組僅納入年齡大于18歲的患者，但因可取材患者有限，難以消除統計學差異。且本研究僅以貴州醫科大學附屬醫院就診的小部分KOA患者為研究對象，并且多數為病變較重，K-L分級Ⅲ級、Ⅳ級者，因此今后仍需多中心、大樣本，納入更多Ⅰ、Ⅱ級KOA患者的研究進一步探討。