SPE-UPLC-MS/MS法測定方便面及其料包中5種罌粟殼生物堿

李坤全，王春雷

（聊城市檢驗檢測中心，山東聊城 252000）

罌粟殼系成熟罌粟去掉果實之后干燥的果殼，其含有嗎啡（Morphine）、可待因（Codeine）、那可丁（Noscapine）、罌粟堿（Papaverine）和蒂巴因（Thebaine）等生物堿[1]，這些成分有斂肺止咳、鎮靜止痛、止瀉等功效[2]，但也有一定的成癮性，一些不良商家正是看到了這一點，才鋌而走險，將罌粟殼加入火鍋底料、烹調香料、羊肉湯、麻辣燙、醬鹵肉和飲料等食品中，以此來吸引“回頭客”。如果長期食用這些食品會使人出現虛汗、乏力、面黃肌瘦、精神萎靡等[3]。2009年監管部門規定罌粟殼禁止添加于火鍋食品中，2011年又將禁用的產品類別范圍擴大為“火鍋底料及小吃類食品”，并列出主要成分為“罌粟堿、那可汀、可待因、嗎啡”，從而有效保證人們飲食安全。

目前罌粟殼生物堿的主要檢測方法有光譜法（如分光光度法）、色譜法（如薄層色譜法、氣相色譜法和液相色譜法）、電泳法、免疫分析法、質譜法（如氣相色譜質譜法、液相色譜質譜法）等方法。這其中分光光度法只能對嗎啡定性和半定量測定；薄層色譜法易受干擾；電泳法重現性差，多作為輔助檢測方法；免疫分析法抗體保存時間有限，容易產生交叉反應；氣相色譜法和氣相色譜質譜法不適于難揮發、強極性和易熱解化合物的檢測，而液質聯用法靈敏度、準確度高，精密度好，可進行痕量分析，各組分無需基線分離。

現有文獻報道中研究者已經對醬鹵肉[4]、火鍋底料[5]、羊肉湯及湯料[6]、烹調香料[7]、藥酒[8]和植物油[9]中5種罌粟殼生物堿成分進行了檢測，但是還有一種備受消費者喜愛且容易越吃越上癮的食品——方便面至今沒有檢測報道，故本研究從方便面切入，以固相萃取為凈化手段，結合UPLC-MS/MS建立了方便面及其料包中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因5種生物堿的檢測方法，準確度高、檢出限低，二級質譜可有效避免假陽性的出現。

1 材料與方法

1.1 材料

方便面：均來自于政府組織的農村地區流通環節食品安全專項抽檢中的方便面樣品，其中B品牌、J品牌和K品牌各抽出10個，共計30個待測樣品，并按照GB/T 5009.1—2003的要求制備樣品。

1.2 試劑

甲醇（CH3OH，HPLC級）和乙腈（ACN，HPLC級）均購買于OCEANPAK公司；鹽酸（分析純，AR）和氨水（AR）均購買于煙臺遠東精細化工有限公司；正己烷（農殘級）：天津市光復精細化工研究所；甲酸（HPLC級）：天津市大茂化學試劑廠；乙酸（HPLC級）：西隴科學股份有限公司；鹽酸罌粟堿（1 μg/mL）、鹽酸那可丁（1 μg/mL）、蒂巴因（1 μg/mL）、嗎啡（50 μg/mL）、 可 待 因（50 μg/mL）、 嗎 啡 -D3（100 μg/mL）和可待因-D3均購買于MEDJEN LLC公司；MCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制備

混合標準工作液：分別精密移取1 μg/mL罌粟堿、那可丁和蒂巴因溶液和50 μg/mL嗎啡和可待因溶液各1.00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得含罌粟堿、那可丁、蒂巴因濃度為100 μg/L和嗎啡、可待因濃度為5 mg/L的混合標準品溶液。

混合內標工作液：分別精密移取嗎啡-D3和可待因-D3內標物質（100 μg/mL）各1.00 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到嗎啡-D3、可待因-D3的濃度均為1.0 μg/mL的混合內標溶液。

1.3.2 質譜條件

多反應監測模式（MRM），正離子電噴霧離子化（ESI+），離子化電壓為5 500 V，離子源溫度為550 ℃，氣簾氣壓力為35 psi，霧化氣壓力為50 psi，輔助加熱氣壓力為50 psi，各化合物的檢測離子對、碰撞能量（Collision Energy，CE）、去簇電壓（Declustering Potential，DP）、射入電壓（Entrance Potential，EP）和碰撞室射出電壓（Collision Cell Exit Potential，CXP）等質譜參數見表1。

表1 5種罌粟殼生物堿的化學信息、保留時間和質譜參數

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Luna? Omega C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流動相；含0.1%甲酸水溶液為A相，甲醇為B相；梯度洗脫程序：0～1.00 min，70%A；1.00～3 min，70%A→10%A；3～5 min，10%A；5～ 5.1 min，100%A → 70%A；5.1～ 6.5 min，70%A；流速：0.4 mL/min；進樣量：10 μL。

1.3.4 樣品前處理

準確稱取樣品2 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，依次加入40 μl內標工作液和20 mL ACN-0.1 mol/L HC（l1∶4，V/V）溶液，渦旋混勻5 min，超聲 10 min，低溫（4 ℃）8 000 r/min離心 5 min，上清液轉移至50 mL離心管中，加入20 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋振蕩2 min，低溫10 000 r/min離心3 min，下層液體待凈化。取MCX固相萃取柱，使用前一次用6 mL水、6 mL ACN活化，準確移取5 mL下清液上柱，保持流速每滴1～2 s，然后依次用6 mL水、6 mL ACN淋洗去除雜質，用6 mL 5%（V/V）氨水乙腈洗脫，收集洗脫液于15 mL離心管中，40 ℃氮吹至干，加入1.00 mL CH3OH-0.1%甲酸水（3∶7，V/V）定容，過0.22 μm濾膜后上機測試。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優化

5種生物堿均為堿性化合物，酸性環境中易溶于水，因此可用酸性溶液進行提取，提取液用有機溶劑萃取去除脂溶性雜質，再用固相萃取柱進行深度凈化，最后洗脫液旋干復溶過膜上機測定。本實驗分別用0.1 mol/L HCl溶液、1%醋酸溶液、ACN-0.1 mol/L HC（l1∶1，V/V）溶 液、ACN-0.1 mol/L HC（l1∶4，V/V）溶液、CH3OH-0.1 mol/L HC（l1∶1，V/V）溶液和CH3OH-0.1 mol/L HC（l1∶4，V/V）溶液進行加標回收，結果表明（圖1），使用0.1mol/L HCl溶液和1%醋酸溶液進行提取時5種化合物的回收率基本上低于50%，回收效果較差，當使用ACN-0.1mol/L HC（l1∶1，V/V）溶 液、CH3OH-0.1 mol/L HC（l1∶1，V/V）溶液和CH3OH-0.1 mol/L HC（l1∶4，V/V）溶液提取時嗎啡的回收效果較差，回收率小于50%，這可能是由于在前處理過程中出現乳化現象，當使用ACN-0.1 mol/L HC（l1∶4，V/V）溶液進行提取時回收率均大于80%，雖有乳化現象的發生，但可以通過低溫高速離心盡量降低損失，故本實驗最終將ACN-0.1mol/L HC（l1∶4，V/V）作為提取液。

圖1 不同提取溶液下5種生物堿的回收率

前處理過程中還有一項任務就是盡可能地去除溶劑效應和基質效應，食品樣品種類多，基質復雜，要建立一個適合所有樣品的高效統一的凈化方法實屬不易，因此實驗過程中提取液凈化后氮吹去除乙腈，然后再用初始流動相復溶，以此來減小溶劑效應；同時為更好地降低基質效應，實驗過程中不同品牌的方便面使用不同的基質標準曲線。此外對于凈化方式而言，DB 31/2010—2012[10]和 BJS 201802[11]中加無水醋酸鈉、無水硫酸鎂的主要作用是除水和促進生物堿從水相轉移到有機相，提取凈化效率有待研究[12-13]；還有學者[14]采用QuEChERS法凈化，此法的確簡便快捷，但是PSA能強力吸附嗎啡，C18可吸附罌粟堿、蒂巴因、嗎啡、可待因導致回收率較低，提取后直接進樣會使基質干擾物增多；固相萃取是較為常見的凈化手段，文獻報道[15]使用C18柱嗎啡無保留，HLB柱嗎啡和那可丁無保留，由于5種生物堿極性較大，故可使用MCX和PCX來凈化，實驗中對比二者的凈化效果，MCX略優于PCX，故最終采用MCX來凈化。

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

實驗中以基質匹配的方法繪制標準曲線，將空白樣品提取液作為稀釋液，精確配制0.01～10.0 μg/L的罌粟堿、那可丁和蒂巴因的混合標準工作液，0.1～100.0 μg/L的嗎啡和可待因的混合標準工作液（其中含嗎啡-D3和可待因-D3均為10.0 μg/L），各取5 μL上機測試，以標準品濃度為橫坐標，罌粟堿、那可丁和蒂巴因以峰面積為縱坐標，嗎啡和可待因以峰面積和內標物峰面積比值為縱坐標，繪制標準曲線，得到的線性方程、線性系數和線性范圍見表2，結果表明罌粟堿、那可丁和蒂巴因在0.01～10.00 μg/L范圍內，嗎啡和可待因在0.1～100.0 μg/L范圍內線性關系良好，線性系數（r2）＞0.999 8，這表明該法適用于方便面中5種罌粟殼類生物堿的檢測。一般以信噪比（S/N）為3的含量定為方法的檢出限（LOD），以信噪比（S/N）為10的含量定為方法的定量限（LOQ），5種生物堿的檢出限和定量限見表2，檢出限介于0.21～1.24 μg/kg，定量限介于0.66～4.65 μg/kg。

表2 5種生物堿的線性方程、線性系數、線性范圍、檢出限和定量限

2.3 回收率和精密度

取空白樣品（檢測結果為陰性的樣品），每份稱取2.0 g樣品，分別加入低、中、高3個水平（其中罌粟堿、那可丁和蒂巴因的添加濃度為0.10 μg/kg、0.20 μg/kg和 0.40 μg/kg，嗎啡和可待因的添加濃度為2.5 μg/kg、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg）的標準溶液適量，每個濃度平行6份，按照1.3.4的方法進行前處理制得待測溶液，上機檢測含量，計算回收率，結果顯示（表3），在3種不同品牌的方便面中5種生物堿的回收率為72.02%～110.09%，相對標準偏差為（RSD）為1.05%～4.25%，說明該方法能夠滿足不同方便面樣品的分析要求。具體來看嗎啡和可待因的回收率（85.19%～110.09%）要明顯優于罌粟堿、那可丁和蒂巴因的回收率（72.02%～107.21%），這可能是因為嗎啡和可待因采用內標法定量，能夠很好地減小基質效應，而其余罌粟堿、那可丁和蒂巴因雖然采用基質匹配標曲外標法定量，但還會或多或少的受到基質干擾，而這一點在3種化合物0.10 μg/kg下的加標回收時尤為明顯，因此以后的實驗中可以采取其他方式（如在線稀釋、開發內標定量法等）近一步降低基質效應。

表3 5種生物堿在不同品牌方便面及不同加標濃度下的回收率和精密度（n=6）

2.4 二級質譜及其譜庫建立

在實際工作中，由于食品樣品基質復雜，傳統質譜分析的MRM工作模式很容易產生基質效應，導致保留時間和離子比率有偏差，或出現“假峰”，產生假陽性，干擾判斷。為克服此弊端，實驗利用SCIEX復合質譜QTRAP系統獨有的復合掃描模式MRM-IDA-EPI，即三重四極桿和線性離子阱的預掃描方式（Survey Scan）相結合觸發增強離子掃描（EPI），可以在一針進樣的同時獲得MRM色譜峰和增強型二級碎片，其中MRM色譜峰用來定量，EPI不同能量符合二級譜圖形成“指紋”圖譜，實現搜庫和確證，確保檢測結果的準確性。實驗過程中取5種生物堿和兩種內標物溶液單標（濃度為5 μg/L）依次進樣，MRM-IDA-EPI采集模式，將得到的標準譜圖和化合物信息加入數據庫中，建立譜庫并逐一對假陽性樣品進行比對確認。

2.5 實際樣品測定

采用本研究構建方法對政府抽檢的3個品牌的方便面30個樣品進行5種罌粟殼生物堿的定性篩查和定量分析，結果顯示有3個樣品（K品牌2個、B品牌1個）在保留時間1.15 min時嗎啡兩離子對出峰，4個樣品（K品牌2個、J品牌2個）那可丁有一個離子對（414.2/220.2）出峰，4個樣品（J品牌3個、K品牌2個）可待因有一個離子對（300.2/165.2）出峰，考慮到保留時間和離子比率等因素，采集這11個樣品的二級質譜圖，并與標準譜圖進行對比，結果顯示11個樣品3種成分的匹配度（Purity）均小于50%，為陰性樣品。

3 結論

本研究通過使用MCX柱對方便面樣品進行提純凈化，并結合UPLC-MS/MS的MRM和MRMIDA-EPI采集模式建立了方便面中5種罌粟殼生物堿的分析方法，方法檢出限低，靈敏度高，準確度高，精密度好。采用超高效液相色譜，可在6.5 min內完成一個樣品的分析，大大提高了分析效率，同時建立了5種生物堿的二級質譜圖庫，能有效快速地對陽性樣品進行篩查，確保結果的準確性。本研究不但為罌粟殼生物堿檢測方法國標的制定提供了參考，而且為依法打擊食品中非法添加罌粟殼行為提供有利依據，保障消費者的合法利益。