食用菌的活性成分及其安全檢測分析研究

張志秀

（北京京誠生物科技有限公司，北京 102600）

食用菌作為一種高附加值的大型真菌，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、碳水化合物、各種維生素、礦質(zhì)元素等營養(yǎng)成分，具有高蛋白、低糖、低脂肪、低膽固醇的特點。此外，食用菌中含有多種生物活性物質(zhì)，如多糖、萜類化合物等，這些化合物大多具有抗氧化、抗腫瘤等生理功能。自然界中有2 000多種食用菌，大約200種是商業(yè)或?qū)嶒炘耘嗟摹Ｆ渲须p孢蘑菇、香菇、平菇、黑木耳、金針菇和草菇等20種已實現(xiàn)規(guī)模化栽培[1]。食用菌按其主要用途可分為食用菌和藥用菌。例如，香菇、金針菇被用于人們的日常飲食，而靈芝、冬蟲夏草則是常用的草藥。

目前，食用菌生物活性成分的功能、結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系成為當(dāng)前研究的前沿陣地，且取得了很大進(jìn)展，同時對于這些活性成分的分離、純化、鑒別、結(jié)構(gòu)測定等的方法也在不斷地發(fā)展和完善。此外，在食用菌生產(chǎn)過程中，面臨著農(nóng)藥殘留、重金屬、甲醛等污染問題[2]，如果所含污染物較高的食用菌流入市場，則會威脅食用者的生命健康，存在較大的安全隱患。當(dāng)前世界各地都高度重視食用菌食品安全檢測技術(shù)的開發(fā)，我國也在投入大量的人力物力，加速相關(guān)檢測和監(jiān)控技術(shù)的開發(fā)，進(jìn)一步保障我國食用菌產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展。本文將針對食用菌活性成分的鑒別及分析檢測研究進(jìn)行綜述，為食用菌的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 食用菌生物活性成分及其分析檢測

食用菌是一類可供食用和藥用的大型真菌的總稱。如表1所示，食用菌不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和纖維素等，還有豐富的礦質(zhì)元素。大量的研究實驗都對目前常見的食用菌的基本營養(yǎng)成分進(jìn)行了測定，大大地挖掘了食用菌的食用和藥用價值[3-5]。

表1 食用菌基本營養(yǎng)成分情況統(tǒng)計（單位：mg/kg）

1.1 食用菌多糖

食用菌多糖具有良好的營養(yǎng)和醫(yī)療作用，是一種很有前途的保健品營養(yǎng)成分。食用菌多糖主要是以β-葡聚糖的形式展現(xiàn)，其主鏈為梳狀結(jié)構(gòu)，由β-（1-3）連接的葡萄糖基和沿主鏈隨機(jī)分布的β-（1-6）連接的葡萄糖基組成[6]。食用菌多糖的生物活性取決于多糖的種類、分子量、分支和結(jié)構(gòu)構(gòu)象，這些多糖通過與不同受體的相互作用發(fā)揮不同的生物活性。研究發(fā)現(xiàn)食用菌多糖具有抗氧化衰老、抗腫瘤、治療動脈硬化、抗炎、止痛、祛風(fēng)、降壓和止咳解毒等多種功效。

1.1.1 食用菌多糖的分離純化

目前主要通過醇析法、色譜法、電泳法以及超濾等技術(shù)對食用菌多糖進(jìn)行分離純化[7]。經(jīng)過分離純化的食用菌多糖在測定結(jié)構(gòu)之前必須對其純度和分子量進(jìn)行測定，目前，檢查食用菌多糖常用的方法主要有以下5種：①利用氣相色譜（GC）、高效氣相色譜（HPLC）測定組成多糖的單糖的摩爾比是否恒定；②通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或者玻璃纖維紙電泳進(jìn)行測定，如果電泳只出現(xiàn)一條帶，說明純度可靠；③利用凝膠柱層析進(jìn)行分析，層析圖出現(xiàn)對稱的單峰則為可靠，如果出現(xiàn)“拖尾”現(xiàn)象，說明其均一性不夠好；④通過紫外分光光度計法，在260 nm、280 nm處檢測是否有吸收峰出現(xiàn)；⑤通過紙層析法，檢測是否呈現(xiàn)單一集中的斑點。

1.1.2 食用菌多糖的結(jié)構(gòu)解析

對于多糖結(jié)構(gòu)的檢測分析，通常有以下6種：①對食用菌多糖完全水解之后，通過HPLC或者氣相色譜測定單糖的種類及摩爾比；②利用甲基化方法、高碘酸氧化法與Switch降解法研究和確定糖苷鍵及支鏈點的連接位置；③通過紅外光譜的方法研究和確定糖苷鍵為呋喃型或吡喃型；④通過2D核磁共振技術(shù)對食用菌多糖的異頭碳構(gòu)型進(jìn)行檢測和確定；⑤通過甲基化分析方法和核磁共振光譜分析結(jié)合的方法，對食用菌中單糖殘基和重復(fù)的單元序列進(jìn)分析；⑥利用紫外光譜法確定單糖分子量的分布。

1.2 萜類物質(zhì)

萜類化合物是由甲戊二羥酸衍生、且分子骨架以異戊二烯單元（C5單元）為基本結(jié)構(gòu)單元的化合物及其衍生物。在食用菌中，三萜類化合物以及倍半萜類化合物居多，含有27～30個碳原子，6個異戊二烯單位[8]。大量研究發(fā)現(xiàn)，食用菌中的萜類物質(zhì)表現(xiàn)出優(yōu)異的抗癌、抗氧化、抗炎等活性，是當(dāng)前食用菌中分布較為廣泛的一類天然有機(jī)物，因此受到人們廣泛的關(guān)注。

1.2.1 萜類物質(zhì)的提取

目前，主要可以通過超聲波、微波輔助提取、超聲輔助提取、超臨界流體萃取和制備衍生物法等手段對食用菌中的萜類物質(zhì)進(jìn)行提取。就目前研究和應(yīng)用的實際情況看來，通過氯仿、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑對食用菌中的三萜類物質(zhì)進(jìn)行提取較為廣泛，但是也存在提取物水溶性較差等缺陷，而超聲波以及微波輔助提取工藝的穩(wěn)定性和提取率等都相對較高，目前正在被大范圍的推廣當(dāng)中，成為當(dāng)前的研究熱點。

1.2.2 萜類物質(zhì)的分離純化

對于食用菌中萜類物質(zhì)的分離純化，采用大孔吸附樹脂法及硅膠柱層析法是目前較為主流的方法，而通過這種吸附方法所得到的食用菌萜類物質(zhì)相對較為粗糙，含有色素等雜質(zhì)，因此可以通過硅膠柱層析進(jìn)行進(jìn)一步的純化。此外，分配柱色譜法、反相液相色譜法等也都應(yīng)用到食用菌萜類物質(zhì)的分離純化當(dāng)中。

1.2.3 萜類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析

食用菌三萜類化合物的結(jié)構(gòu)解析較為煩瑣，但是仍然還有其規(guī)律可循，可以從以下3個方面考慮：①三萜類化合物分子量及分子式的確定；②三萜皂苷中母核的類型、糖基的個數(shù)以及苷化的位置；③糖基連接的位置及順序等。通常來講，可以通過紅外光譜、質(zhì)譜以及核磁共振等手段對食用菌中的萜類化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，同時萜類化合物中的不飽和鍵相對較少，因此紫外光譜的使用就相對較少。除此之外，由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，可以通過半合成或者全合成的方法制備相應(yīng)的合成產(chǎn)物，從而來確證天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。

1.3 活性蛋白

食用菌中含有多種活性蛋白，其中最常見的是凝集素和真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白（Fungal Immunomodulatory Protein，F(xiàn)IP）。FIP是一種小分子蛋白，分子量為12～15 kDa，而凝集素的分子量為12～190 kDa，大部分為大分子蛋白，由4個亞基組成。在不同的食用菌中，F(xiàn)IP至少含有1個α-螺旋和7個β-折疊，其氨基酸序列高度同源[9]。由于結(jié)構(gòu)上的差異，食用菌蛋白參與多種生理功能的調(diào)節(jié)，如抗癌、抗病毒、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等。此外，在食用菌中還發(fā)現(xiàn)了抗病毒蛋白、核糖體失活蛋白、漆酶等活性蛋白，它們在分子量和結(jié)構(gòu)上存在差異。

1.3.1 食用菌活性蛋白的分離純化

目前，透析、超濾、離心、分子篩、瓊脂糖凝膠、Ni-NTA樹脂和DEAE純化技術(shù)等都廣泛應(yīng)用到食用菌蛋白的純化當(dāng)中。其中透析和超濾技術(shù)可以有效實現(xiàn)食用菌中蛋白質(zhì)和其他金屬離子的分離，分子篩和樹脂純化技術(shù)可以得到不同分子量的蛋白質(zhì)，但是這些分離純化的過程也會伴隨產(chǎn)生很多雜質(zhì)，因此還需要DEAE純化。

1.3.2 食用菌活性蛋白的測定和結(jié)構(gòu)解析

可以通過凱式定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、酚試劑法和考馬斯亮藍(lán)法對食用菌中的活性蛋白含量進(jìn)行測定。此外，蛋白質(zhì)是生命體活動的主要基礎(chǔ)物質(zhì)，對于其結(jié)構(gòu)和功能的解析一直在研究當(dāng)中，因此當(dāng)前對于活性蛋白結(jié)構(gòu)的解析方法和手段也都適用于食用菌活性蛋白，比如X-射線晶體衍射、核磁共振波譜、電鏡三維重構(gòu)、顯微鏡技術(shù)以及計算機(jī)模擬等技術(shù)。

2 食用菌安全檢測技術(shù)研究

2.1 農(nóng)藥殘留分析檢測

農(nóng)藥殘留已經(jīng)是當(dāng)前食品安全中的一個重大隱患，且已引起了廣泛關(guān)注。雖然農(nóng)藥的使用大大提升了食用菌的產(chǎn)量，但對人體健康的負(fù)面影響也逐漸凸顯出來，從而對食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了一定的限制。目前主要通過化學(xué)分析方法、比色法和微生物法等手段來檢測食用菌中的農(nóng)藥殘留，其中應(yīng)用較為廣泛的是氣相色譜、液相色譜和色質(zhì)聯(lián)用等方法，這些方法和手段具有操作簡單、分析速度快、分離效果好以及靈敏度高等優(yōu)勢[10]，可以對食用菌中的多殘留物質(zhì)進(jìn)行分析，而其一般不適用于現(xiàn)場分析。而在微生物檢測分析方法中，較為流行的是免疫分析方法，由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，可以初篩一些致癌物質(zhì)和劇毒物質(zhì)，因此適合于現(xiàn)場初篩，但是其檢測的盲目性也限制了其進(jìn)一步的推廣和應(yīng)用[11]。此外，超臨界流體色譜技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)以及生物傳感器等新興的技術(shù)和元件等都開始相繼應(yīng)用到食用菌農(nóng)殘的檢測分析當(dāng)中。

2.2 重金屬污染檢測

在培育食用菌時，如果所用生產(chǎn)輔料、農(nóng)藥中含有重金屬，或者栽培食用菌的土壤及灌溉用水中的重金屬含量較高，則會被食用菌吸收，長期使用便會在菌體內(nèi)出現(xiàn)富集。對于食用菌的重金屬污染問題，目前主要通過原子吸收光譜法、原子熒光光度法、電感耦合等離子體質(zhì)譜分析法等對其進(jìn)行檢測[12]。此外，酶抑制法和免疫學(xué)檢測等手段表現(xiàn)出較快的檢測速度和較高的靈敏度，且操作性和選擇性都相對較強(qiáng)[13]，因此被大量應(yīng)用到食用菌重金屬污染的現(xiàn)場檢測當(dāng)中，可以實現(xiàn)對現(xiàn)場樣品的快速掃描和初篩，大大減少了重金屬污染檢測費用，提升了檢測效率。

2.3 甲醛污染檢測

在食用菌實際生產(chǎn)過程中，偶爾也會把甲醛當(dāng)作環(huán)境的殺菌消毒劑，由于它對使用者的眼和鼻也有刺激作用，因此近些年很少使用。而目前一些商販為了讓食用菌外觀看上去更加光潔，會加入次硫酸氫鈉，其毒性與其分解產(chǎn)物甲醛有著很大的關(guān)系。甲醛在進(jìn)入人體之后，會與人體蛋白質(zhì)結(jié)合、破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、損害人體肝臟和腎臟。目前在對食用菌的甲醛進(jìn)行檢測時，一般會借助分光光度法、電化學(xué)分析法、高效液相色譜分析法等。此外，催化動力學(xué)光度法、傳感器分析法由于其較高的靈敏度、低成本和高穩(wěn)定性等優(yōu)勢[14]，也被廣泛應(yīng)用到食用菌的甲醛污染檢測當(dāng)中。

2.4 生物污染檢測

食用菌栽培基質(zhì)的原材料極易受到微生物污染，毒素通過食用菌的菌絲吸收至子實體中，造成食用菌污染。此外，在食用菌生產(chǎn)加工及儲藏的過程中，微生物也會分泌毒素，導(dǎo)致食用菌變質(zhì)。在現(xiàn)實生產(chǎn)過程中，金黃色葡萄球菌腸毒素、沙門氏菌、蠟樣芽胞桿菌等都是近些年我國食用菌產(chǎn)品中經(jīng)常被檢測出的微生物污染類型[15]，對消費者健康造成了極大影響，因此提升食用菌生物污染檢測技術(shù)至關(guān)重要。目前對于食用菌微生物的檢測主要集中在毒素檢測和有害病原微生物檢測兩個方面。在毒素檢測方面，層析法、色譜法以及酶聯(lián)免疫法是較為主流的檢測方法[16]，此外，當(dāng)前已研發(fā)出基于ELISA法研制的商品化的試劑盒，且針對不同的毒素有不同的試劑盒，可以準(zhǔn)確快速檢測出毒素，只是檢測成本相對較高。在食用菌中的有害病原微生物檢測方面，病原微生物的自動化檢測技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)及培養(yǎng)基生理深化特征的檢測等技術(shù)都是當(dāng)前較為主流的技術(shù)。

在食用菌實際生產(chǎn)和食用的過程中，必須要高度重視食用菌的安全檢測，同時加大對于安全檢測技術(shù)的研發(fā)和創(chuàng)新力度，改善原有檢測技術(shù)中的不足，從而對食用菌的安全質(zhì)量做出準(zhǔn)確判斷。