腫瘤標志物在部分消化道腫瘤診斷中的研究進展

彭 宇 胡 淼 酈亦帆 李茂婷 姚定康

2019年1月國家癌癥中心發布的統計數據顯示，結直腸癌(CRC)、肝細胞癌(HCC)分別居中國惡性腫瘤發病率的第3、第4位，HCC的病死率居消化道惡性腫瘤之首；隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，CRC的發病率可能超越胃癌[1]。由于早期腫瘤患者缺乏特異性癥狀和體征，故確診時多已發展至中、晚期。近年來，隨著免疫學和分子生物學技術的發展，涌現出一些與細胞生長和增殖有關的生物標志物，其在腫瘤早期診斷方面具有獨特優勢。根據腫瘤標志物的性質將其分為3類：蛋白組學、基因組學和細胞學標志物。血清蛋白組學標志物以甲胎蛋白(AFP)為代表，是HCC在分子生物學診斷領域的金標準。近年來，miRNA在腫瘤診斷領域的研究進展迅速，是用于診斷惡性腫瘤的穩定且無創性生物標志物。循環腫瘤細胞(CTC)不同于任何現有的腫瘤生物標志物，可通過識別靶基因及其特定突變對CTC進行分析，從而指導診斷和治療，目前美國FDA已批準使用CellSearch系統進行CTC檢測，CTC可用于預測轉移性乳腺癌、前列腺癌和CRC患者的預后。近年來發現的一系列生物標志物不僅有助于探究消化道腫瘤的發病機制，也為早期診斷提供了潛在策略。本文就新發現的一些腫瘤生物標志物在HCC和CRC早期診斷中的應用作一綜述。

1 血清蛋白標志物

1.1 骨橋蛋白

骨橋蛋白(OPN)是一種相對分子質量為34 000的多功能磷酸化糖蛋白，其可在不同細胞類型中表達，包括T淋巴細胞、巨噬細胞和破骨細胞[2-4]。近年來OPN的研究熱點在于其參與腫瘤發生及細胞增殖、侵襲和轉移的過程。Zhu等[5]的研究進一步證明了OPN可通過活化巨噬細胞中的集落刺激因子1/集落刺激因子1受體(CSF1/CSF1R)途徑，促進巨噬細胞的趨化性遷移和選擇性激活，并可促進HCC中程序性死亡配體1(PD-L1)的表達；還發現即使在直徑<2 cm的腫瘤中，HCC患者的血清OPN水平也顯著升高，ROC曲線下面積(AUC)為0.851，遠遠大于AFP和Dickkopf1(DKK-1)的AUC，表明OPN是用于HCC診斷的潛在生物標志物[6]。此外，薈萃分析發現OPN用于HCC診斷的敏感度高于AFP，AFP與OPN聯合檢測可提高早期HCC診斷的敏感度[7]。Cheng等[8]發現OPN可通過激活PI3K-Akt-GSK/3β-β/Catenin通路上調CRC中的腫瘤干樣細胞，促進細胞的增殖、侵襲和轉移。Ng等[9]的研究顯示，高血清OPN水平與CRC根治術后轉移有關，提出OPN是監測CRC患者發生轉移的潛在標志物。

1.2 可溶性Axl

Axl與Tyro3、Mer同屬于TAM受體酪氨酸激酶家族，Axl與維生素K依賴的配體生長停滯特異性蛋白6(GAS6)結合而激活，二聚化并轉導下游信號，從而增強腫瘤細胞的增殖、存活、侵襲和轉移能力[10]。Axl經蛋白水解后釋放于血清中，成為可被檢測到的相對分子質量為80 000的可溶性Axl(sAxl)。Song等[11]利用logistic回歸和ROC曲線確定了sAxl用于診斷HCC的最佳截斷值為1 202 pg/mL，敏感度為95.0%，特異度為73.3%，用于診斷AFP陰性的HCC的最佳截斷值為1 301 pg/mL，敏感度為84.6%，特異度為76.3%，表明sAxl診斷HCC的效能優于AFP，尤其是對早期HCC和AFP陰性的HCC的診斷。多中心分析顯示，sAxl診斷肝硬化的敏感度和特異度分別為80.8%、92.0%，診斷HCC的敏感度和特異度分別為83.3%、86.7%，這提示sAxl診斷早期HCC和肝硬化的準確度比AFP更高，還發現sAxl在大多數慢性肝病、肝腺瘤和膽管癌患者中保持正常水平[12]。另一項研究也顯示sAxl在早期HCC診斷方面優于AFP，并且對AFP陰性的HCC患者的診斷準確度較高，而在原發性卵巢癌、乳腺癌、CRC及其肝轉移患者中，sAxl水平均未升高[13]。可見，sAxl診斷早期HCC的特異度較高，是潛在的用于臨床常規檢查的生物標志物。

1.3 尾型同源盒轉錄因子2聯合特異AT序列結合蛋白2

尾型同源盒轉錄因子2(CDX2)是腸道特異性轉錄因子，是結直腸腺癌敏感的生物標志物，其在上腹部消化道腺癌、中腸神經內分泌腫瘤、肺和卵巢黏液癌中也有表達[14]。CDX2的免疫組織化學分析已應用于臨床診斷，用作未知來源腫瘤的腸道分化生物標志物。特異AT序列結合蛋白2(SATB2)是與核基質附著區結合的轉錄因子，可同時激活多個基因的轉錄，參與神經和骨骼系統發育[15-16]，調控腫瘤的發生、發展[17]。Hoskoppal等[18]的研究表明，SATB2是直腸、乙狀結腸和闌尾高分化神經內分泌腫瘤的敏感度和特異度較高的標志物，當懷疑這些部位來源的腫瘤時，其可作為有效的鑒別診斷指標。Ma等[19]的研究發現，在炎癥性腸病(IBD)相關的異型增生和腺癌中，常有SATB2表達缺失，SATB2表達缺失是評估IBD惡性進展的有效的輔助生物標志物。Liu等[20]的臨床研究顯示，高分化結腸腺癌組的SATB2陽性表達率顯著高于低分化結腸腺癌組，無結腸旁腫瘤沉積組的SATB2陽性表達率高于有結腸旁腫瘤沉積組，進一步證明了SATB2表達缺失與原發性結腸癌分化不良及腫瘤沉積有關。SATB2可區分下消化道來源的腺癌與胃、胰腺來源的腺癌，并可區分原發性卵巢癌與CRC卵巢轉移，SATB2是敏感度較CDX2低但特異性更高的結直腸和闌尾來源的腫瘤標志物[21]。Dabir等[22]對CRC轉移患者的活組織檢查進行了回顧性分析，發現CDX2單獨檢測的敏感度和特異度分別為93%、67%，SATB2單獨檢測的敏感度和特異度分別為79%、83%，CDX2與SATB2聯合檢測的敏感度和特異度分別為79%、93%，聯合檢測的高特異度為CRC轉移監測提供了可行的補充方案。總之，CDX2與SATB2相比較，CDX2的敏感度較高，而SATB2的特異度較高，兩者聯合檢測可作為補充標志物，為CRC的特異性診斷提供了新的選擇。

2 miRNA

miRNA是包含20～22個核苷酸的非編碼RNA分子，可在轉錄后調控基因表達水平，從而調控細胞的增殖、分化及凋亡。Lin等[23]制定了一個miRNA分類器，包含7個差異表達的miRNA(miR-29a、miR-29c、miR-133a、miR-143、miR-145、miR-192和miR-505)，用于診斷HCC；在4個隊列中，該分類器診斷HCC的敏感度均高于AFP，特異度與AFP無明顯差異；此外，該miRNA分類器還能診斷早期HCC和AFP陰性的HCC患者，其可作為臨床前參數對HCC患者進行篩查。近年來，miR-21和miR-122在HCC的診斷、預后和治療靶點中的應用價值是研究的熱點。薈萃分析顯示，miR-21診斷早期HCC的敏感度和特異度分別為86.6%、79.5%，miR-122診斷早期HCC的敏感度和特異度分別為68.0%、73.3%，表明miR-21和miR-122是潛在的用于早期HCC診斷的生物標志物[24]。研究表明，與肝硬化患者相比，HCC患者血漿中miR-122、miR-21和miR-96的表達水平明顯升高，含有miR-122、miR-21和miR-96的外泌體miRNA試劑盒可用于HCC診斷[25]。Long等[26]的研究發現，與AFP相比，miR-88用于診斷HCC具有更高的準確度(99.5%比76.5%)、敏感度(100.0%比63.8%)和特異度(99.2%比84.2%)，其診斷腫瘤直徑<3 cm的HCC的準確度高達100.0%，而AFP僅為64.7%，表明血清miR-88是一個高度敏感的指標，可準確地診斷早期HCC和其他慢性肝病。

miR-21不僅在HCC的診斷和預測預后中表現突出，miR-21和miR-20a在CRC中的作用機制和臨床應用也成為了近年來研究的熱點[27]。Peng等[28]的薈萃分析納入了57項研究，結果表明血液循環中的miR-21可能適合作為CRC的診斷性生物標志物，而組織中的miR-21可能是CRC的預后標志物。miR-20a是多種生物學過程和惡性腫瘤進展中的重要分子，既往研究表明miR-20a高表達與胃癌的不良預后相關[29]。Liu等[30]對4個基因表達綜合數據庫(GEO)和癌癥基因組圖譜(TCGA)進行了全面分析，結果提示miR-20a對CRC具有診斷價值。Hao等[31]整合并分析了3個miRNA數據集，通過生物信息學分析發現5個差異表達的miRNA(miR-145、miR-497、miR-30a、miR-31和miR-20a)與CRC相關，其可能是CRC診斷和治療的潛在靶標。上述研究提示，miRNA可作為早期消化道腫瘤診斷的無創性生物學標志物。

3 細胞學標志物

3.1 CTC

CTC的概念于1869年首次被提出，指來自原發性腫瘤或轉移性腫瘤，存在于外周血中的各類腫瘤細胞。利用CTC獨特的物理和分子特性，目前已開發了多種系統以完善CTC檢測，眾平臺可大致分為基于免疫親和力的富集法、基于生物物理特性的富集法和無富集法3類[32]，目前較常用的是基于免疫親和力的CanPatrol CTC富集技術。Cheng等[33]應用CanPatrol CTC技術分離不同類型的CTC(上皮CTC、間充質CTC和混合CTC)，結果顯示晚期HCC患者的外周血間充質CTC數量多于早期HCC患者，總CTC和AFP診斷HCC的AUC分別為0.774和0.669，表明CTC診斷HCC的效能優于AFP，總CTC與AFP聯合診斷HCC的AUC為0.821，提高了HCC診斷的敏感度。Qi等[34]的研究顯示，112例HCC患者中有101例(90.2%)在早期CTC即呈陽性，還發現支鏈氨基酸轉氨酶1(BCAT1)過表達可能通過觸發上皮-間質轉化(EMT)誘導CTC釋放，并可能是HCC轉移的重要生物標志物，表明CTC可用于監測早期腫瘤及復發、轉移。Wang等[35]應用基于上皮細胞黏附分子(EpCAM)的CTC-(BioT)Chip平臺，發現CTC陽性率和數量與腫瘤TNM(淋巴結轉移)分期之間存在顯著相關性。然而，由于大多數HCC細胞低表達EpCAM，限制了該平臺在富集HCC的CTC方面的廣泛應用。因此，開發一種具有較高敏感度和較低成本的HCC的CTC檢測方法至關重要。Liu等[36]應用成像流式細胞術(IFC)來檢測HCC患者血液樣本中的CTC，具有較高的核質比(HKR)，與基于CD45-EpCAM+細胞的傳統CTC檢測方法相比，應用HKR細胞的IFC的AUC更大(0.820比0.720)。

CTC對于CRC患者的臨床意義已得到證實。Kure等[37]應用“聚合CTC芯片”(CTC-Chip)系統檢測13例Ⅱ～Ⅳ期CRC患者血液樣本中的CTC，包括癌胚抗原(CEA)和CA19-9呈陰性的Ⅱ、Ⅲ期CRC患者，結果均檢測到了CTC，Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的CTC平均水平低于Ⅳ期患者，表明CTC可成為有效的腫瘤標志物。一項納入了2 363例非轉移性CRC患者的薈萃分析顯示，CTC陽性患者的總生存期和無病生存期較短，CTC陽性也與區域淋巴結轉移、浸潤、血管侵犯、腫瘤分級和淋巴結轉移(TNM)分期密切相關[38]。綜上所述，CTC有助于早期發現腫瘤復發和轉移，但目前并無理想的標志物可以捕獲所有CTC并排除正常細胞，而有些上皮CTC在發生EMT時有可能丟失上皮表型，使得抗EpCAM的方法無法捕獲這類細胞。考慮到腫瘤細胞群體的異質性導致的腫瘤標志物差異性表達，新技術應將基于單一生物標志物的檢測方法擴展到基于多種生物標志物的方法，并將微流體技術用于單細胞的富集和分析。

3.2 炎性細胞比率

炎性反應與腫瘤的發生、發展密切相關，在腫瘤細胞侵襲和轉移中起著重要作用，炎性反應指數反映了全身性炎性反應的嚴重程度。Li等[39]評估了中性粒細胞/淋巴細胞比值(NLR)、血小板/淋巴細胞比值(PLR)、淋巴細胞/單核細胞比值(LMR)、CEA對CRC的診斷效能，它們單獨診斷的AUC分別為0.723、0.779、0.800和0.792，CEA分別與NLR、PLR、LMR聯合診斷的AUC均顯著大于其單獨診斷(P均<0.001)，PLR+LMR+CEA的聯合診斷方案表現出最佳的CRC診斷效能(AUCPLR+LMR+CEA=0.936、AUCNLR+PLR+CEA=0.930、AUCNLR+LMR+CEA=0.912)。另一項研究也顯示，NLR和PLR診斷CRC的效能較高，而NLR、PLR、平均血小板體積(MPV)聯合診斷的效能(AUC=0.904)明顯優于單個標志物(AUC=0.790、AUC=0.846、AUC=0.816)[40]。Hu等[41]評估了NLR、AFP、GGT/血小板比值(GPR)在HCC患者干預前的診斷效能，結果顯示NLR或GPR與AFP聯合診斷的AUC分別為0.953、0.916，均大于NLR、GPR或AFP單獨診斷(AUC=0.663、AUC=0.853、AUC=0.895)，表明將NLR或GPR與AFP 聯用可提高早期HCC的診斷效能。在AST、ALT、AFP和NLR這4種生物標志物中，AFP和NLR診斷HCC的AUC(0.775、0.738)、敏感度(0.561、0.539)和特異度(0.881、0.858)相近，而AFP與NLR聯用在所有兩兩組合中的AUC(0.769)最大，敏感度(0.767)和特異度(0.773)最高，表明AFP與NLR聯用更有助于臨床篩查[42]。此外，多項研究表明CRC或HCC患者治療前的炎性反應標志物與預后不良有關，其中NLR可作為炎性反應標志物用于檢測腫瘤的進展[43-45]。需要注意的是，炎性反應標志物與各種疾病相關，因此使用單個炎性反應標志物診斷腫瘤可能會導致假陽性，需聯合其他類型的生物標志物進行診斷。

4 總結

用于HCC和CRC診斷的3類生物標志物中，有的標志物研究尚處于實驗階段，有的已應用于臨床。單一標志物對特定器官的檢測能力有限，敏感度和特異度較低，而聯合應用兩種及以上不同類型的標志物，可減少干擾因素的影響，有助于與非腫瘤性疾病的鑒別，提高診斷效能。理想的腫瘤標志物應具有以下特點：(1)特異度較高，僅在腫瘤患者中被檢測到；(2)敏感度較高，可在疾病早期被檢測到；(3)與腫瘤分期相關，可監測腫瘤轉移；(4)具有器官特異性，可鑒別不同器官來源的腫瘤。部分腫瘤標志物的診斷效能較現有金標準更有優勢，但單中心、小樣本研究結果可能存在偏倚，同一標志物在不同研究條件下的結果存在差異。今后需繼續探究具有較高診斷價值的腫瘤標志物，并對其進行多中心、大樣本研究驗證。