裂殖壺菌產脂肪酸和二十二碳六烯酸的研究進展

郭 姝 何萬領 李曉麗

河南科技大學動物科技學院微量元素與生物健康實驗室，河南洛陽471023

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid ，DHA）是一種重要的ω-3 脂肪酸，由于可以促進大腦發育、減少產后抑郁、治療癌癥、抑制發炎、改善老人癡呆等，被用于保健品和食品中。同時因為對于嬰幼兒智力及視力發育尤其重要，成為某些品牌奶粉的最大賣點。近年來研究發現，DHA 可以改善畜禽的生產性能，產出含DHA 的畜產品，對畜牧業也有著深遠的影響。海洋微藻是DHA 的直接來源且經濟環?！，F階段微藻的培養技術日益成熟，不僅油脂含量高而且產量穩定，通過發酵微藻來提取油脂制備DHA已經成為了研究的熱點方向。其中，裂殖壺菌因為可以生產多種不飽和脂肪酸，并具有非常高的脂質百分比而成為獲取DHA 的最佳選擇。關于裂殖壺菌產脂肪酸的研究主要涉及誘變、破壁、發酵、金屬離子的影響、培養條件和提取技術幾個方面，但總結性報告較少。為此，本文梳理概述裂殖壺菌在生產脂肪酸方面的相關技術，以期為海洋微藻的研究和DHA行業的后續發展提供參考。

1 裂殖壺菌的誘變

誘變是指通過控制外部環境條件誘使遺傳基因隨之變異，然后在產生的變異株中選出實驗所需要的優良品種。誘變通?？梢源笾路譃槲锢碚T變和化學誘變。物理誘變指利用射線、微波或激光等來處理菌株，因此也稱為輻射育種。在物理誘變中，應用最廣泛的2 種方法是紫外誘變和常壓室溫等離子體誘變。化學誘變是使用一些化學藥物促使菌株的遺傳物質發生改變，這些化學藥物也稱為誘變劑?；瘜W誘變的誘變劑主要包括某些烷化劑、抗生素、堿基類似物等，常見的誘變劑有硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、乙烯亞胺和疊氮化鈉等。

1.1 常壓室溫等離子體（ARTP）誘變

常壓室溫等離子體（ARTP）是近幾年新提出的一種大氣壓輝光放電冷等離子體源。它能夠在大氣壓下產生溫度在25～40 ℃的、具有高活性粒子濃度的等離子體射流，可以在與組織或者細胞之間發生如催化、診斷、激發反應等復雜而可控的生化過程，因而廣泛應用于誘變育種。ARTP 在生物領域的應用有如下優點：效率高，成本低，操作簡單，綠色環保等優點[1]。

研究表明，ARTP 誘變可用于蘇云金芽孢桿菌及其他菌種提高高產率[2]。袁軍等[3]將編號為ATCC20888 原始裂殖壺菌菌株的懸浮液經過ARTP處理后，在2，2’-聯吡啶平上板培養，發酵培養所有突變菌株并通過磷酸香草醛油脂快速檢測法和氣相色譜分析，最后選育出的DHA高產菌株油脂中的主要飽和脂肪酸含量明顯下降，而不飽和脂肪酸含量明顯增加。

1.2 紫外誘變

紫外線是一種非電離輻射，可以通過促使DHA分子形成嘧啶二聚體，減弱雙鍵間氫鍵的作用，并引起雙螺旋結構扭曲變形，還可以引起堿基轉換、顛換、移碼突變或缺失[4]。目前紫外誘變已經廣泛用于多種菌種。高若珊等[5]通過紫外誘變的方式獲得了4株比原始菌株耐熱性、產酸性更好的菌株，可以在75 ℃的溫度30 min 以后依然保持較好的活力和產酸能力，其中編號為1.1801-1912Z 的菌株比原菌種產酸量提高了31.05 g/L。田磊等[6]紫外誘變篩選小柴旦鹽湖鹽單胞菌得到產量超過原始菌株2倍的正向突變菌株。劉薈[7]經38 W 的紫外燈下，誘變距離20 cm 對小球藻CS-510 進行紫外誘變，篩選得到的藻株發酵以后的生物量和油脂含量分別比出發菌株提高了11.3%和34.3%。許永等[8]通過采用紫外誘變選育出的兩株突變裂殖壺菌的菌株，其生物量和DHA 含量分別較對照組高8.08%、11.57%和13.74%、28.75%。

1.3 復合誘變

在長期使用誘變劑之后，菌株很容易產生“疲勞效應”。這種效應會延長菌株的生長周期、減少孢子量、減慢代謝等，對發酵工藝的控制極其不利。為了避免這種情況的產生，在實驗過程中可以采用幾種誘變劑復合處理或者交叉處理菌株的方法進行誘變。復合誘變包括：先后使用兩種及以上誘變劑，重復使用同一種誘變劑和同時使用兩種及以上的誘變劑。一般認為，復合誘變可以產生協同效應，假如使用兩種及以上誘變劑進行合理搭配使用遠比一種誘變劑的誘變效果好。

李慧玲等[9]通過對裂殖壺菌進行紫外線和硫酸二乙酯的復合因素的誘變，通過篩選培育以后獲得一株正向突變的優勢菌株，在相同的條件下發酵培養，比原始菌種的生物量、油脂和DHA 產量分別提高了7.54%、16.65%、48.79%。趙犇等[10]對裂殖壺菌的原始菌株進行甲基磺酸乙酯和ARTP 復合誘變，并將通過2 種因素復合誘變選育出來的菌株與2 種單因子分別誘變篩選出來的菌株進行比較。結果顯示，復合誘變的正突變率達到32.2%，遠高于2 種單因子誘變；復合誘變選育出的裂殖壺菌菌株，其DHA 產量和DHA 在油脂中的比例比原始菌株分別高35.6%和19.2%。李悅明等[11]用化學試劑亞硝基胍和紫外線相結合的方式對生產用裂殖壺菌進行誘變，篩選得到一株優勢突變菌株。其油脂含量和DHA含量比出發菌株分別提高17%和14%。

2 裂殖壺菌的破壁與油脂提取

裂殖壺菌的細胞壁很難被破碎，因此發酵培養以后的油脂提取率較低[12]。在科學實驗或者生產實踐的過程中，選擇哪種方法來破碎裂殖壺菌的細胞壁，對油脂的得率和品質有著重大影響，同時也決定油脂提取的生產成本。因而找出高效、便捷和綠色環保的細胞破碎方法，對DHA產業未來的發展具有深遠的意義。

目前，破壁的方法主要有酸熱法、生物酶法、均質法、蒸爆法、超聲法、反復凍融法、微波法、真空冷凍干燥后提取和噴霧干燥后提取法。研究表明，與其他方法相比，酸熱法和生物酶法不僅操作便捷，而且提取的油脂含量和DHA含量也最高，但是缺點是若大規模使用酸熱法提取油脂較為耗能；生物酶解法不僅破壁效果好，油脂得率高，還具有比其他方法明顯的優越性，在酶解過程中，成本較低，綠色環保，因此，適宜進行大規模油脂提取[13-14]。均質法、蒸爆法和超聲法提取的油脂含量與酸熱法和酶解法相比較低。從工業化的角度來看，超聲法破壁提取油脂對于設備要求比較高，蒸爆法則耗能耗時，相比之下均質法則較為理想，油脂中DHA 含量僅次于酸熱法和酶解法。其他的破壁方法如反復凍融法、噴霧干燥法和真空冷凍干燥的破壁效果均不理想。

3 裂殖壺菌的發酵

發酵指通過微生物在有氧或無氧條件下的生長發育來制備菌體自身或代謝產物的過程。微生物發酵的生產水平依賴于菌種自身的特性、發酵培養基組成和發酵的環境條件[15]。現階段國際上對于裂殖壺菌的研究主要集中發酵條件的優化，如碳源、氮源、碳氮比、無機鹽以及溶氧量、pH 等方面的研究[16-18]。裂殖壺菌的培養主要分為細胞生長、分裂階段和脂質積累階段，因此采用兩步發酵法即采用分批發酵培養和培養條件改變，可以實現高密度發酵和油脂的大量積累[19]。在細胞生長、分裂階段需要提供足夠的營養以滿足細胞生長繁殖的蛋白質、核苷等的合成。

裂殖壺菌的生物量、油脂產量及DHA的積累受到多方面發酵因素的影響。碳源和氮源的添加量和添加比例對油脂的合成有重要影響。研究顯示，在發酵過程中補糖可以提高發酵后裂殖壺菌的生物量，促進油脂和DHA的積累，但糖濃度不宜太高，否則會抑制裂殖壺菌的發酵[20-22]。在裂殖壺菌的發酵過程中，溶氧量也是生產油脂、積累DHA 的重要影響因素之一。在裂殖壺菌合成不飽和脂肪酸的過程中，氧的有效供給促進不飽和脂肪酸代謝過程中的去飽和反應，從而直接決定油脂中脂肪酸的組成和含量[23]。但是為獲取足夠的溶氧量生產DHA而在發酵過程中采取通氣培養,也會產生大量泡沫，添加消泡劑可以解決這個問題,但會在一定程度上抑制菌體生長[24]。研究表明，在轉速和裝液量都相同的條件下，在擋板三角瓶中進行發酵比在普通三角瓶，溶氧量更高，因而在擋板搖瓶中發酵的裂殖壺菌的油脂含量更高，發酵時間更短[25]。另外，pH也是研究最多的影響發酵效果的關鍵因素之一[26]，發酵培養基的酸堿度將直接影響菌體的生長及代謝產物的合成。有研究發現，前4 d 的發酵培養基的pH 值控制在3，后2 d 控制為5 時，總脂肪酸和DHA 的產量較大[27]。除此之外，還有很多添加劑對裂殖壺菌的發酵具有促進作用。任路靜等[28]的實驗表明，在裂殖壺菌的發酵培養基中添加生物素，可以有效促進油脂積累，淺藍菌素可以提高DHA及不飽和脂肪酸含量，適當添加VB1、VB3、VB6、VB12對DHA 積累也有促進作用，與生物素復合使用以后促進作用更加明顯。VB12、生物素、VB1、VB6、VB3按照一定的質量濃度加入發酵培養基中，96 h 以后生物量和DHA 產量分別比對照組提高了16.4% 和53.8%[29]。此外，檸檬酸和蘋果酸也對DHA 的產量有積極影響[30]。

研究表明，微量元素大都對微生物生產性能有所影響。曹憲周等[31]發現，Ca2+、Fe2+和Cu2+可以促進酵母的生長。而裂殖壺菌自身不僅含有豐富的Mg、Ca、Na、Fe 等元素，并含有少量的Cu、Mn、K、Zn、Al[32]，可見微量元素是裂殖壺菌生長過程中必不可少的因素。金屬離子可以直接影響菌體中合成脂肪酸的酶的活性，因此對金屬離子的研究具有很重要的現實意義。但是現階段關于金屬離子對裂殖壺菌發酵生產DHA影響的研究仍然較少。

4 研究展望

隨著生活水平的提高，人們越來越注重營養和保健，而DHA可以促進大腦發育，改善視力，具有廣闊的應用前景和發展潛能。目前的研究結果表明，我國在裂殖壺菌油脂產量和DHA 含量方面的研究成果與國外相比仍有很大差距。因此，今后應當重點誘變選育高產量的菌株，深入優化裂殖壺菌的發酵工藝，提高生物量、油脂產量和DHA 含量。同時盡快推廣應用于食品和飼料，最大地發揮其市場價值。