深低溫保存同種異體肌腱的基礎(chǔ)研究進(jìn)展

張佩，王成，楊軍

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院手外科，廣東 珠海 519100)

肌腱是骨骼與肌肉之間力量傳遞的重要組織，常應(yīng)對(duì)較大的力量負(fù)荷，在活動(dòng)過程中易造成急性損傷，因此在臨床工作中肌腱損傷十分常見。肌腱移植在外科重建和修復(fù)治療中的應(yīng)用十分廣泛，肌腱移植材料需求量也日益增加。目前的肌腱移植材料主要包括自體肌腱、異體肌腱、人工肌腱和組織工程肌腱等，其中同種異體肌腱因來源豐富、供區(qū)并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)在臨床及科研工作中應(yīng)用廣泛[1]。移植成功率的提高取決于細(xì)胞活性、生物力學(xué)及免疫原性等方面。深低溫保存是同種異體肌腱常見的處理方法之一，低溫下能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行加工儲(chǔ)存，保證細(xì)胞和組織機(jī)構(gòu)及功能的完整性。但低溫冷凍在一定程度上會(huì)破壞細(xì)胞，嚴(yán)重的細(xì)胞應(yīng)激還可導(dǎo)致不可逆的損傷，通過添加保護(hù)劑可以實(shí)現(xiàn)有效的緩沖，降低溶液的冰點(diǎn)，避免細(xì)胞暴露于有害濃度下，而且保護(hù)劑還可穿透細(xì)胞膜保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)[2]。同時(shí)，在解凍和復(fù)溫時(shí)，還需要考慮細(xì)胞濃度、冷凍保護(hù)劑的選擇和濃度以及解凍速率等。在冷凍保存前和冷凍保存后均需評(píng)估細(xì)胞的活力和功能，以便進(jìn)一步優(yōu)化冷凍保存過程[3]。為實(shí)現(xiàn)最佳移植效果，需進(jìn)一步提高對(duì)低溫生物學(xué)的認(rèn)識(shí)。現(xiàn)就深低溫保存同種異體肌腱的基礎(chǔ)研究進(jìn)展予以綜述。

1 深低溫保存定義

深低溫(深低溫冰箱-70～-80 ℃,液氮-196 ℃)保存是保持肌腱固有特性的良好儲(chǔ)存手段。低溫可以抑制正常機(jī)體組織細(xì)胞代謝活動(dòng)，使其不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)過程，理論上，在此溫度下的所有生物活動(dòng)均會(huì)停止，包括一些導(dǎo)致細(xì)胞死亡的生物化學(xué)活動(dòng)，深低溫保存肌腱可為臨床提供具有細(xì)胞活性和彈性良好的供體，且深低溫保存同種異體肌腱移植效果與自體肌腱差異較小[4]。

深低溫保存包括普通程序降溫和玻璃化。普通程序降溫是逐步降溫，而玻璃化保存法是一種采用高濃度冷凍保護(hù)劑和單步快速降溫的技術(shù)，可使細(xì)胞內(nèi)外同時(shí)玻璃化，減少細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成造成的滲透性損害。玻璃化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，需要具有較特定閾值更快的冷卻、升溫速率，但這取決于所使用的玻璃化溶液的組成和總濃度。深低溫保存法不僅能夠有效消除肌腱免疫原性，還能很大程度地保留細(xì)胞活性，同時(shí)維持力學(xué)性能。

2 冷凍保護(hù)劑

常規(guī)的冷卻方案在低溫保存過程中可形成冰晶并增加溶質(zhì)濃度，溶質(zhì)濃度升高引起的損害可以通過使用冷凍保護(hù)劑來減輕。冷凍保護(hù)劑可與細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)合，防止冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，減輕快速結(jié)冰帶來的不可逆性細(xì)胞損害，同時(shí)還可避免細(xì)胞脫水引起滲透性增高造成的破壞作用。Sass等[5]用常見的冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜和甘油低溫保存肌腱，并比較天然肌腱和低溫保存肌腱的生存活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)低溫保存和解凍處理后，肌腱成纖維細(xì)胞的增殖能力并未發(fā)生顯著變化。Hochstrat等[6]研究發(fā)現(xiàn)，使用二甲基亞砜低溫保存肌腱組織可保持細(xì)胞活力，而在0.9%氯化鈉溶液中保存的肌腱則無(wú)殘留的代謝活性，在冷凍過程中細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)被完全破壞。李雯瑛[7]將外周血造血干細(xì)胞深低溫保存于二甲基亞砜和羥乙基淀粉保護(hù)劑中，細(xì)胞存活率高，且回收后外周血造血干細(xì)胞在體內(nèi)能夠快速恢復(fù)活性。Isildar等[8]使用二甲基亞砜和10%1,2-丙二醇制備了兩種不同的冷凍保護(hù)液用于保存臍帶組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在冷凍保護(hù)劑中保存的臍帶組織的形態(tài)學(xué)和免疫表型與新鮮臍帶組織無(wú)顯著差異，同時(shí)可分離相似的間充質(zhì)干細(xì)胞，且從10% 1,2-丙二醇冷凍保護(hù)液中分離的細(xì)胞的增殖速率較新鮮組織分離的細(xì)胞低，但均可觀察到成骨和成脂分化。由此可知，加入冷凍保護(hù)劑的深低溫保存細(xì)胞的增殖分化能力良好，與新鮮組織細(xì)胞的增殖分化能力的差異較小。同時(shí)，冷凍保護(hù)劑種類、濃度及配比也會(huì)影響保存效果，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)組織及細(xì)胞的特性選擇合適的冷凍保護(hù)劑。

3 深低溫保存對(duì)同種異體肌腱細(xì)胞活力的影響

3.1肌腱細(xì)胞 傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，肌腱僅由肌腱細(xì)胞(即肌腱的固有細(xì)胞)組成，經(jīng)深低溫處理后，細(xì)胞受損并失去活性，僅發(fā)揮生長(zhǎng)支架的作用；隨后對(duì)自體肌腱愈合機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)，肌腱細(xì)胞主動(dòng)參與內(nèi)在性愈合過程[9]。由于肌腱細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞液含量少，深低溫保存時(shí)冰晶形成少，因此對(duì)細(xì)胞器及細(xì)胞膜的損傷也較小。孫燕琨等[10]研究表明，與新鮮對(duì)照肌腱相比，經(jīng)深低溫保存的肌腱活細(xì)胞的數(shù)量有所減少，但形態(tài)相似，同時(shí)可分裂、增殖并合成膠原纖維。另有研究表明，冷凍解凍后的肌腱細(xì)胞數(shù)量與新鮮肌腱相近，同時(shí)細(xì)胞水腫、成纖維細(xì)胞增殖等過程也與新鮮肌腱相似[11-12]。楊宇升等[13]研究表明，同種異體肌腱經(jīng)深低溫保存后早期組織學(xué)愈合過程較自體肌腱延遲，但24周后愈合程度與新鮮肌腱基本相同。由此可知，經(jīng)深低溫保存后，肌腱細(xì)胞的活性和數(shù)量均受到一定損傷，但仍能生長(zhǎng)、增殖并參與愈合過程。

3.2肌腱干細(xì)胞 肌腱由纖維膠原束平行排列組成，組織內(nèi)血供少，組成的成纖維細(xì)胞為成體細(xì)胞，代謝較低且自我修復(fù)過程緩慢，增殖分化能力也十分有限。與成纖維細(xì)胞相比，肌腱干細(xì)胞具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[14]。肌腱干細(xì)胞是一種新型細(xì)胞，已成功地從人類、小鼠和新西蘭兔肌腱及韌帶組織中分離出來[15-16]。Zhang和Wang[17]研究表明，與肌腱細(xì)胞相比，肌腱干細(xì)胞具有不同的特性，包括細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)、增殖和分化潛能以及細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的形態(tài)等方面的差異。體外的肌腱干細(xì)胞可分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及骨細(xì)胞；體內(nèi)的肌腱干細(xì)胞可分化形成肌腱、軟骨及骨組織[18]。而肌腱細(xì)胞幾乎不存在分化潛能。還有研究發(fā)現(xiàn)，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，肌腱干細(xì)胞的增殖更快，可表達(dá)更多肌腱相關(guān)基因與蛋白，組織學(xué)也可較早觀察到膠原纖維束的規(guī)則排列，同時(shí)具有更豐富的細(xì)胞外基質(zhì)[19]。Ni等[20]研究表明，肌腱干細(xì)胞可表達(dá)更多的與肌腱分化相關(guān)的信使RNA，具有肌腱干細(xì)胞的纖維蛋白結(jié)構(gòu)較無(wú)肌腱干細(xì)胞的結(jié)構(gòu)修復(fù)更早進(jìn)行。可見，肌腱干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖分化能力，在促進(jìn)肌腱的修復(fù)和愈合過程中起關(guān)鍵作用。

深低溫處理會(huì)損傷肌腱干細(xì)胞，并對(duì)其功能產(chǎn)生一定影響。但Mitchell等[21]研究表明，深低溫保存肌腱干細(xì)胞與新鮮肌腱的活力、數(shù)量、形態(tài)、早期凋亡率、體外遷移能力以及分化能力無(wú)顯著差異，解凍后24 h的肌腱干細(xì)胞仍處于原代，而解凍72 h后的大部分肌腱干細(xì)胞處于第四代增殖。因此，肌腱干細(xì)胞在肌腱損傷修復(fù)過程中極其重要。肌腱干細(xì)胞具有與正常細(xì)胞相似的生長(zhǎng)、增殖和代謝過程，能夠定向分化為肌腱細(xì)胞，分泌膠原纖維，維持完整的肌腱結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮正常的生理功能，進(jìn)一步促進(jìn)肌腱損傷的愈合[22]。

4 深低溫保存對(duì)同種異體肌腱生物力學(xué)性能的影響

肌腱的主要功能是力量傳遞，因此肌腱移植術(shù)后的抗拉強(qiáng)度和韌性是決定手術(shù)成敗的關(guān)鍵因素之一。目前暫未對(duì)深低溫保存中肌腱的生物力學(xué)性能的損傷達(dá)成共識(shí)。有學(xué)者認(rèn)為，深低溫保存對(duì)肌腱生物力學(xué)性能無(wú)影響[12,23-24]。Lee和Elliott[25]研究表明，雖然冷凍可以改變肌腱的微觀結(jié)構(gòu)，但在肌束和纖維水平上，新鮮肌腱與冷凍肌腱的所有參數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明冷凍對(duì)肌腱力學(xué)無(wú)影響，不會(huì)引起相應(yīng)的機(jī)械或結(jié)構(gòu)變化。Chen等[26]認(rèn)為，新鮮冷凍的伸肌腱是伸肌機(jī)制重建的可行選擇，盡管同種異體肌腱的細(xì)胞活力偏低，但其生物力學(xué)性能顯著恢復(fù)。Negrín等[27]在重建內(nèi)側(cè)髕韌帶的生物力學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，同種異體肌腱移植承受的最大拉伸力、剛度和伸長(zhǎng)率等足以使其在體內(nèi)進(jìn)行重建并發(fā)揮正常功能。然而，有部分研究認(rèn)為深低溫保存可導(dǎo)致肌腱的結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)性能發(fā)生顯著變化。如Giannini等[28]將22例深低溫處理的脛骨后肌腱與新鮮對(duì)照肌腱進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)深低溫處理肌腱的極限荷載、極限應(yīng)力以及極限應(yīng)變均較新鮮肌腱有所降低，對(duì)肌腱力學(xué)性能有一定影響。Lansdown等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍保存過程中，冷凍溫度、冷凍介質(zhì)種類及濃度以及多次凍融循環(huán)，可以改變結(jié)構(gòu)特性，并導(dǎo)致不同的生物力學(xué)結(jié)果。可見，深低溫保存過程中多種因素會(huì)對(duì)力學(xué)性能產(chǎn)生影響。

4.1冷凍溫度 與常溫相比，低溫可通過抑制代謝和顯著延緩離體組織儲(chǔ)存過程中降解的生理過程來穩(wěn)定生物結(jié)構(gòu)。Hohmann等[30]研究表明，無(wú)論冷凍或解凍的溫度如何，冷凍后肌腱的機(jī)械性能均會(huì)發(fā)生一定變化，低溫保存后，肌腱彈性增大。Oswald等[31]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)液氮處理肌腱的蠕變應(yīng)變和初始破壞應(yīng)變均顯著提高，且最大應(yīng)變顯著降低。因此，在低溫保存前對(duì)肌腱進(jìn)行快速冷凍可降低肌腱的負(fù)荷能力。與極低冷凍溫度下的低溫保存類似，經(jīng)液氮處理的肌腱損傷可能由迅速降溫的冷凍過程引起。因此，在同種異體肌腱移植的滅菌過程中，由于可能對(duì)肌腱性能產(chǎn)生負(fù)面影響，故不應(yīng)使用液氮處理。緩慢、溫和的凍存過程可減少冰晶形成，而冷凍溫度的影響可能與液體丟失、滲透性改變以及其他物理?yè)p傷相關(guān)。評(píng)估反復(fù)冷凍和解凍溫度的研究顯示，冷凍對(duì)肌腱性能無(wú)影響[32]。

4.2冷凍介質(zhì) 在目前的冷凍保存方法中，0 ℃以下組織及器官結(jié)構(gòu)不受控制的冰晶形成是唯一最關(guān)鍵的因素，嚴(yán)重限制了冷凍和解凍過程中的儲(chǔ)存效果。低溫保存通常置于磷酸鹽緩沖液中，不添加任何低溫保護(hù)劑[33]。Chen等[34]研究表明，等滲緩沖溶液保證了細(xì)胞處于流體狀態(tài)時(shí)的活力。冷凍可導(dǎo)致冰晶形成，破壞肌腱細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，使生物力學(xué)性能發(fā)生改變，而通過使用基于玻璃化的無(wú)冰冷凍保存技術(shù)可以較好地解決冰晶形成的問題。Hochstrat等[6]研究表明，二甲基亞砜對(duì)肌腱細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)具有積極作用，與磷酸鹽緩沖液中儲(chǔ)存的肌腱相比，二甲基亞砜?jī)?chǔ)存可以增強(qiáng)肌腱的生物力學(xué)特征；二甲基亞砜在冷凍過程中保持了肌腱細(xì)胞的活力，電鏡下，磷酸鹽緩沖液凍存肌腱的膠原纖維形態(tài)更不規(guī)則，而二甲基亞砜?jī)龃娴募‰靹t保留了膠原結(jié)構(gòu)。肌腱組織中主要為Ⅰ型膠原，Ding等[35]證明，凍融使膠原蛋白溶液形成微孔結(jié)構(gòu)，孔隙主要被水填充，在凍結(jié)過程中，微孔結(jié)構(gòu)變得更小、更有規(guī)則，導(dǎo)致膠原結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而使用二甲基亞砜作為保護(hù)劑可以減少膠原結(jié)構(gòu)變化。加入冷凍保護(hù)劑可以減少低溫帶來的冰晶損傷，使低溫保存肌腱的結(jié)構(gòu)與新鮮肌腱更接近，以維持正常的生物力學(xué)性能。

4.3凍融循環(huán) 新鮮冷凍是同種異體移植最常用的保存方法，與單次凍融循環(huán)相比，重復(fù)經(jīng)歷多個(gè)周期凍融對(duì)人肌腱的生物力學(xué)性能有一定影響。多次凍融循環(huán)會(huì)改變肌腱結(jié)構(gòu)特性，導(dǎo)致生物力學(xué)性能變化[29]。Suto等[36]研究表明，反復(fù)的凍融循環(huán)會(huì)降低骨和肌腱結(jié)構(gòu)中骨細(xì)胞的存活率，但不會(huì)影響肌腱的機(jī)械性能。Hochstrat等[6]表明，新鮮肌腱與冷凍一次的肌腱具有相似的動(dòng)態(tài)楊氏模量。應(yīng)用兩個(gè)以上的凍融循環(huán)可能加劇肌腱組織的損傷，顯著降低其最大負(fù)荷[25]。黃洪杰等[37]研究證實(shí)，凍融周期應(yīng)少于3次，反復(fù)凍存復(fù)溫會(huì)加劇肌腱組織損傷，使其易發(fā)生斷裂。Chen等[34]研究表明，反復(fù)凍融可改變新西蘭兔跟腱的組織結(jié)構(gòu)，使跟腱的最大負(fù)荷、最大負(fù)荷能量和最大應(yīng)力等部分生物力學(xué)性能顯著降低。Arnout等[38]研究表明，3個(gè)周期內(nèi)的凍融循環(huán)對(duì)生物力學(xué)性能無(wú)影響。相比之下，多次凍融循環(huán)削弱了同種異體肌腱移植的生物力學(xué)性能，使移植物更容易疲勞，甚至斷裂[37]。

深低溫保存對(duì)肌腱生物力學(xué)的影響與多種因素有關(guān)，包括冷凍溫度、冷凍介質(zhì)、凍融循環(huán)以及凍存時(shí)間、個(gè)體差異等。深低溫在維持細(xì)胞代謝的同時(shí)也會(huì)對(duì)力學(xué)性能造成負(fù)面影響。針對(duì)不同個(gè)體及不同部位的移植要求，在保證功能的前提下盡可能多地保留肌腱力學(xué)特性。

5 深低溫保存對(duì)同種異體肌腱免疫原性的影響

雖然自體肌腱移植一般不會(huì)發(fā)生排斥反應(yīng)，但自體肌腱來源非常有限，無(wú)法滿足臨床需求。由于同種異體肌腱較豐富且不會(huì)導(dǎo)致新的創(chuàng)傷，近年來已成為研究熱點(diǎn)。如果不去除同種異體肌腱的免疫原性，移植后將發(fā)生嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，導(dǎo)致手術(shù)失敗，嚴(yán)重者甚至危及生命。因此，降低宿主與移植物的免疫排斥反應(yīng)是目前亟待解決的問題。

5.1免疫機(jī)制 肌腱主要由肌腱細(xì)胞、膠原纖維以及細(xì)胞外基質(zhì)等組成，其中肌腱細(xì)胞為抗原性的主要來源。未經(jīng)處理的異體肌腱移植后可出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞，引起毒性反應(yīng)，導(dǎo)致受體內(nèi)產(chǎn)生以細(xì)胞免疫為主的免疫排斥反應(yīng)。產(chǎn)生細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)的主要途徑有：①供體抗原呈遞細(xì)胞被受體T淋巴細(xì)胞直接識(shí)別；②受體T淋巴細(xì)胞識(shí)別肌腱細(xì)胞膜上被加工處理后的組織相容性復(fù)合物[39]。深低溫保存可改變肌腱細(xì)胞膜上的組織相容性抗原，從而降低異體肌腱的抗原性。有研究表明，CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞主要通過細(xì)胞免疫和體液免疫的聯(lián)合作用參與機(jī)體免疫排斥反應(yīng)[40]，因此臨床可以通過CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞的比值間接描述免疫排斥反應(yīng)的嚴(yán)重程度。

5.2免疫相關(guān)細(xì)胞及蛋白的表達(dá) 自體肌腱移植是肌腱損傷后功能恢復(fù)重建的重要治療手段。自體肌腱移植術(shù)后并發(fā)癥少，且無(wú)顯著不良反應(yīng)，但供體來源有限。而異體肌腱移植與組織或器官移植類似，受體會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)。張紅星等[41]采用玻璃化保存法凍存同種異體肌腱，并與空白對(duì)照組(未經(jīng)處理的同種異體肌腱)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，玻璃化凍存同種異體肌腱移植后CD4、CD8、CD4/CD8均顯著減少，在一定程度上減弱了同種異體移植產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)，進(jìn)一步提高了移植成功率。Chen等[42]證明，肌腱的化學(xué)萃取可以消除免疫原性，而且每次處理均可進(jìn)一步降低免疫原性。宮妍婕等[43]使用液氮凍存心臟瓣膜發(fā)現(xiàn)，保護(hù)液對(duì)心肌組織結(jié)構(gòu)及其蛋白成分均具有更好的保護(hù)作用，且反映移植后排斥反應(yīng)程度的人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體分子的表達(dá)水平最低，表明深低溫保存、化學(xué)處理、添加保護(hù)劑等均在降低同種異體肌腱免疫原性中起到不同程度的協(xié)同作用，繼而使同種異體肌腱免疫原性顯著降低，但各種方法聯(lián)合處理時(shí)存在多種變量，為進(jìn)一步研究帶來挑戰(zhàn)。

5.3移植與隨訪 同種異體肌腱體外保存的目的是為臨床移植提供良好的受體，改善肌腱功能，提高患者生活質(zhì)量。體內(nèi)移植與隨訪的結(jié)果可更加直觀地判斷療效和預(yù)后。涂澤松等[44]的試驗(yàn)顯示，與自體肌腱重建前交叉韌帶相比，同種異體肌腱移植的臨床效果相似，但免疫排斥反應(yīng)率低且安全，臨床可根據(jù)病情及患者意愿靈活選擇。另有研究指出，自體肌腱移植效果優(yōu)于深低溫保存的同種異體肌腱移植，如Fawzi-Grancher等[45]研究表明，與新鮮肌腱相比，凍干處理的骨骼和肌腱未見顯著的細(xì)胞毒性；與植入后2周的新鮮冷凍肌腱相比，凍干處理的輻照肌腱的CD3、CD68浸潤(rùn)顯著減少；且在新鮮冷凍/凍干輻照處理兩個(gè)肌腱組織中均未觀察到巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的顯著差異。由此認(rèn)為，冷凍干燥聯(lián)合輻照等其他物理化學(xué)方法可能對(duì)降低免疫原性起到疊加作用。鄧亞開等[46]對(duì)自體-異體混編肌腱與深低溫保存同種異體肌腱重建兔前交叉韌帶進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，自體-異體混編肌腱組CD31免疫組織化學(xué)染色血管計(jì)數(shù)及蘇木精-伊紅染色細(xì)胞計(jì)數(shù)在術(shù)后3、8、12周均高于深低溫保存同種異體肌腱組，達(dá)到一定峰值后，自體-異體混編肌腱組與深低溫保存同種異體肌腱組的差異逐漸減小。深低溫保存同種異體肌腱免疫排斥反應(yīng)雖較自體肌腱多見，但在較長(zhǎng)時(shí)間的術(shù)后隨訪中趨于穩(wěn)定并愈合良好。

6 小 結(jié)

深低溫保存同種異體肌腱能夠維持細(xì)胞和組織活性以及良好的生物力學(xué)性能，且可有效去除免疫原性，減少排斥反應(yīng)的發(fā)生，是目前臨床和科研工作中最常用的保存方法。但深低溫保存同種異體肌腱還應(yīng)考慮成本、時(shí)間、機(jī)械強(qiáng)度變化以及疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，可根據(jù)患者的年齡、活動(dòng)水平、活動(dòng)類型、并發(fā)癥以及患者的需求等多種因素制訂不同的保存方案[47]。深低溫保存過程中相關(guān)的因素眾多，與降溫速度、冷凍保護(hù)劑的配比及濃度等均有較大關(guān)系。同時(shí)，冷凍保護(hù)劑存在細(xì)胞毒性，如何控制其毒性達(dá)到最佳保護(hù)效果，臨床需進(jìn)一步研究探索。未來仍應(yīng)支持深低溫保存在同種異體肌腱移植中的應(yīng)用，以提高成功率。