Keap1-Nrf2-ARE 通路及其參與肝臟疾病病理機制研究進展

楊繡榮，王 斌，胡曉夢，王婉怡

(浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江舟山 316022)

氧化應激(oxidative stress，OS)和抗氧化的平衡調節是人體維持內環境穩定和正常生理功能的一個基本調節體系，亦是人體自我保護、抵御疾病的重要機制之一[1-4]。當受到外源(如環境有害物質、紫外輻射、霧霾等)或內源(如肝損傷、腫瘤、炎癥等)有害因素傷害時，機體內活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生和清除失衡，過剩的ROS 攻擊大分子物質，導致DNA 突變，促使核酸和蛋白質交聯，破壞細胞膜結構，導致細胞功能喪失，出現OS[5-6]。因此，OS 在肝損傷、糖尿病、腫瘤、心血管疾病等發生和發展中扮演了舉足輕重的作用。研究證實細胞膜和線粒體膜上的磷脂層多不飽和脂肪酸在OS 狀態下會發生嚴重的脂質過氧化反應，造成肝細胞損傷，導致脂肪肝病、肝纖維化、肝硬化和肝癌等疾病的發生[7]。因此，針對OS 導致肝損傷的作用機制開發高效的抗氧化藥物可有效預防和治療該類疾病，也逐漸成為海洋藥物的重點研究領域。

OS 狀態下過剩的ROS 破壞細胞內大分子物質的生理功能是眾多疾病共同的發病機制，而機體形成了一套復雜的OS 應答系統誘導合成系列的保護性蛋白，降低所受的損害[8]。Keap1-Nrf2-ARE 通路是迄今為止發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路，其可調控II 相解毒酶和抗氧化酶基因的表達，消除或減弱OS 對細胞和器官的損傷[9]。現有研究表明抗氧化肽、植物多酚、萊菔硫烷和齊墩果酸衍生物等可激活Keap1-Nrf2-ARE 通路，調控下游靶基因的表達，預防和降低OS 損傷，抵制炎癥反應的發生[1,3,6]。因此，篩選Keap1-Nrf2-ARE 通路的高效激動劑成為抗氧化藥物的研究熱點。

1 Keap1-Nrf2-ARE 通路及其在氧化應激中的重要作用

核因子NF-E2 相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)主要在肝、腎、肺、皮膚等代謝性和解毒組織器官中表達，是CNC(cap-‘n’-collar)家族中調節氧化應激反應的一種重要轉錄因子，其含有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結構，與胞漿蛋白伴侶分子Keap1(Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白-1)及抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)共同構成Keap1-Nrf2-ARE 通路，在參與細胞抗OS 和外源性有毒物質誘導的主要防御機制中發揮關鍵作用，與肝損傷、衰老、癌癥等疾病聯系密切[8-9]。

II 相解毒酶或抗氧化基因的誘導、激活是機體對氧化損傷和親電子損傷細胞防御的重要部分，可將有害物質在破壞DNA、蛋白質等生物大分子前清除出細胞。在正常生理狀態下，Nrf2 通過N 端與Keap1 特異性結合于細胞質中處于受抑制狀態，細胞內II 相解毒酶類和抗氧化物處于基礎表達水平。當受到ROS 或其他親電試劑刺激時，Nrf2 與Keap1 解偶聯轉移進入細胞核并與小Maf 蛋白結合成異二聚體，進而識別并結合抗氧化反應元件ARE，啟動下游II 相解毒酶和抗氧化酶(NQO1、GST、SOD、γ-GCS、HO-1 等)等基因的轉錄、表達，保護機體和細胞免受OS 產生的過剩ROS 及有害物質的侵害[10-11]。

因此，Keap1-Nrf2-ARE 通路對II 相解毒酶和抗氧化酶的誘導、表達起到決定性作用，是迄今為止發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路。

2 Keap1-Nrf2-ARE 通路激動劑的研究進展

Keap1-Nrf2-ARE 通路在保護細胞和器官免受OS 損傷方面起到了決定性作用，而其激動劑的研究也成為開發預防和治療OS 相關疾病藥物的焦點。研究表明Nrf2 的活化主要有2 種方式：(1)作用于Keap1 上的氨酸殘基，如Cys-151 和Tyr-141，誘導Nrf2 從Keap1 中釋放，或者阻止Nrf2 與Keap1 結合；(2)激活磷酸化信號傳導通路，促使Nrf2 磷酸化而與Keap1 解離，進而增加細胞核內Nrf2 的水平[12]。

2.1 肽類激動劑的研究

Keap1-Nrf2-ARE 通路中，Nrf2 與Keap1 結合時Nrf2 處于受抑制狀態。因此，根據Nrf2 與Keap1 結合結構域的氨基酸序列設計肽類化合物，將可能得到與Keap1 具有較強結合力的活性肽，可作為Nrf2 與Keap1 結合抑制劑(PPI)，提高核內Nrf2 的水平而發揮其生理功能[13]。TU Jingyi,et al[14]研究表明Nrf2 肽(DEETGE-CAL-Tat)可以顯著地降低Nrf2 與Keap1 的結合力，促進Nrf2 進入細胞核啟動下游控制的細胞保護基因的表達，減輕機體所受OS 的傷害。ABED,et al[10]利用表面等離子體共振(SPR)和熒光偏振(FP)試驗測定了系列Nrf2 肽的Kd 值和IC50值，結果表明9 mer Nrf2 肽(H-LDEETGEFL)的Kd 值為352 nmol·L-1，IC50值為3.48 μmol·L-1，顯示出與Keap1 最強的結合能力。在此基礎上，ABED 對16mer Nrf2 肽(AFFAQLQLDEETGEFL-OH) 與Keap1 的結合方式進行了研究，結果發現Keap1 上6 個氨基酸殘基(Ser363、Asn382、Arg380、Arg415、Arg483 和Ser508)的側鏈與16mer Nrf2 上Glu79 和Glu82 的羰基形成氫鍵，結合于Keap1 的頂部，表明根據Nrf2 的結合域設計兩者之間結合抑制劑可以阻斷Nrf2 與Keap1 的結合，促進Nrf2 作用的發揮。另外，ZHAO Huihui,et al[15]研究表明膠原肽對H2O2誘導的人肝細胞系HL7702 的氧化損傷有保護作用，其可以及時清除細胞內的ROS，增加Nrf2 的表達水平，提高SOD、CAT 的活性，減輕脂質過氧化反應，消除和減弱OS 所致人的正常肝細胞損傷。

2.2 其他小分子激動劑的研究

除活性肽外，植物多酚等化合物也是Keap1-Nrf2-ARE 通路激動劑研究的焦點。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶多酚中的主要抗氧化活性成分，其通過2 種方式激活Nrf2 通路：(1)EGCG 與谷胱甘肽(GSH)結合降低細胞內GSH 水平，導致上游激酶P13K、PKC、JNK 和ERK 的激活，促使Nrf2 磷酸化。(2)EGCG 的電子形式直接與Keap1 上Cys 殘基相互作用，誘導Nrf2 解離[16]。萊菔硫烷(SFN)是綠花椰菜中的一種間接的抗氧化劑，其通過激活Keap1-Nrf2-ARE 通路誘導多種細胞保護蛋白(GR、HO-1 等)的合成抵御OS 對細胞的損傷[17]。KERNS,et al[18]實驗發現：SFN 可直接活化JNK 激酶，并通過降低GSH 水平激活p38，進而激活轉錄激活因子AP-1，最終導致角蛋白17 基因轉錄；另外，SFN 還可以通過降解胞質中Nrf2與Keap1 的結合物而直接刺激Nrf2 的活性。KLESZCZY■SKI,et al[19]實驗發現SFN 能增加HaCaT 細胞中Nrf2 活性及Nrf2 依賴性基因(γGCS、HO-1、NQO1)的表達。姜黃素通過對Keap1 上的Cys151 親電修飾來解離Nrf2-Keap1 復合體，激活Nrf2 的表達，進而誘導GSH 生物合成基因Gclc 和Gclm 的mRNA 來提高GSH 的水平[20]。另外，白黎蘆醇、叔丁基對苯二酚、巴多索隆和齊墩果酸衍生物等亦可激動Keap1-Nrf2-ARE 通路，啟動Nrf2 依賴的基因表達，在OS 狀態下保護細胞和器官[21]。

因此，以Keap1-Nrf2-ARE 通路為靶點，針對性篩選和設計該通路的高效激動劑，將極大提高OS 相關疾病治療藥物開發的成功率。

3 Keap1-Nrf2-ARE 通路參與肝臟疾病病理機制研究

線粒體呼吸鏈復合體利用電子傳遞生產ATP，是ROS 的主要來源，而肝臟富含線粒體成為最易受ROS 攻擊的器官。因此，OS 是引起肝臟病變的主要機制之一，并貫穿肝病的始終。Keap1-Nrf2-ARE 通路抗肝臟損傷涉及調節肝臟的代謝和解毒等環節，在肝臟疾病的治療和預防中發揮重要作用[22]。

3.1 對肝代謝酶表達和炎癥的調節作用

肝代謝酶的解毒過程中II 相解毒酶催化有活性的I 相代謝產物轉化為更具親水性和穩定性的產物，并在III 相代謝排出體外。Nrf2 通過ARE 序列協同調節系列II 相解毒酶基因和III 相代謝酶中載體的表達，加速毒物的轉化和排出[23-24]。另外，Nrf2 通過對炎癥細胞因子的調控，減弱細胞的炎癥反應和氧化損傷[25]。

3.2 對脂肪肝的保護作用

在高脂肪及酒精環境下，過剩ROS 加速肝臟的損傷，引起脂肪性肝炎，肝纖維化和肝硬化等病癥[9]。Nrf2 信號傳導通路通過加強抗氧化物和解毒酶基因的表達，保護肝細胞免受脂質過氧化的損傷；同時Nrf2作用于肝內Fas、Fgf21 和CD36 的基因表達，減少脂肪酸從脂肪組織中的釋放和肝對脂肪酸的攝取[26]。

3.3 對藥物性肝損傷的保護作用

某些藥物在肝細胞內經細胞色素P4502E1 代謝產生過量的ROS 等有害物質，進而破壞線粒體膜完整性和膜Ca2+-ATP 酶系[9]。乙酰氨基酚(APAP)介導的肝損害模型研究表明：Nrf2 通過誘導UGT1A6 表達加快APAP 的排泄；另外，APAP 在非毒性劑量下可激活Nrf2，促進GSH 的從頭合成，從而產生的GSH 與APAP活性代謝產物結合并增加其排出，減弱APAP 毒性[27-28]。

3.4 對肝癌的預防作用

肝癌是導致癌癥死亡的第三大原因。化學致癌物在體內經I 相代謝酶催化后形成具親電子活性的致癌物，進而引起癌基因和抑癌基因的改變。因此，Nrf2 激動劑如蘋果多酚和萊菔硫烷等可有效激動Keap1-Nrf2-ARE 通路，調節II 相解毒酶和抗氧化酶的解毒作用，阻斷或逆轉癌癥發生[29-31]。

3.5 對肝纖維化與肝硬化的作用

肝纖維化的核心問題是ROS 促進肝星狀細胞(HSC)激活并轉化為肌纖維母細胞，以及胞外基質合成增多而降解不足，是進一步向肝硬化發展的重要環節[9,32]。最新研究顯示，Keap1-Nrf2-ARE 信號通路通過促進GCLC、GSTA2 和NQO1 等解毒酶的表達，加速清除肝細胞中的ROS，抑制HSC 的活化，阻斷肝纖維化的進程[33]。

4 結論

基于Keap1-Nrf2-ARE 通路參與肝臟疾病病理機制，Nrf2 激動劑已被應用于體內外實驗，結果證明激動劑通過激活Keap1-Nrf2-ARE 通路促進II 相解毒酶等系列基因的表達，有效對抗疾病引起的組織損傷。因此，Keap1-Nrf2-ARE 通路被認為是開發保肝護肝藥物的一個重要靶點。