單細胞測序技術在胰腺癌研究中的應用

崔芳 彭立嗣 金震東

海軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科，上海市胰腺疾病研究所，上海 200433

胰腺癌是惡性程度極高的消化系統腫瘤之一，雖然近年來預后稍有改善，但5年生存率仍不足9%[1]。胰腺癌早期診斷困難，大多數診斷明確時已屬中晚期。胰腺癌的具體發病機制目前仍不清楚，從基因層面研究有助于進一步了解其瘤內異質性及惡性進展，從而對胰腺癌的早期診斷、分期及尋找新的藥物治療靶點提供理論基礎。單細胞測序技術可以檢測到單個細胞的基因變化，便于進一步加深對胰腺癌組織內不同細胞異質性的認識。

一、單細胞測序技術的研究進展

2009年Tang等[2]首次報道了基于高通量測序的單細胞轉錄組測序方法，近10多年來相關技術得到飛速發展。2011年Navin等[3]開發了單細胞基因組測序技術，2013年湯富酬課題組[4]實現了單細胞全基因組甲基化測序。2015年Drop-seq[5]和inDrop技術[6]相繼推出，通過微流控技術結合升級液滴和條形微珠，微珠直接捕獲mRNA，極大提高了測序細胞通量，降低了成本。2017年Zheng等[7]提出10×GemCode技術，該技術將條碼反應液滴以油滴封裝，反轉錄效率更高，且樣本量可提高至10萬個。目前常用的10×Genomics Chromium系統便是基于該技術。

在單細胞轉錄組測序方面，近年來又涌現出數種單細胞RNA-seq的cDNA擴增方法，包括PCR擴增(Tang/Brady[2,8]方法、Smart-seq[9]、Smart-seq2[10]、STRT-seq[11]和SMA[12])、體外轉錄擴增(qCell expression by linear amplification and sequencing，CEL-seq)[13]和Phi29聚合酶擴增(Phi29-mRNA amplification，PMA)[14]3類。以Smart-seq為例，Smart-seq技術設計了兩個特殊引物，引物1用于定位至mRNA的3′端，保證了逆轉錄酶的起始位置，結合MMLV(moloney murine leukemia virus)逆轉錄酶，可以在新合成的cDNA的3′末端多出幾個C堿基，引物2可以與其發生雜交，引導MMLV酶以cDNA第一鏈為模板發揮DNA聚合酶作用，從而獲得全長雙鏈cDNA。2014年該方法優化后研發出了具有更高靈敏度、準確度和覆蓋度的Smart-seq2技術。目前，以STRT-seq和Smart-seq2為代表的PCR擴增方法已經成為最常用的單細胞cDNA文庫擴增策略，廣泛應用于商業化平臺及新型技術中。

目前，單細胞基因組測序技術由于捕獲效率問題落后于轉錄組學[14]。單細胞全基因組擴增主要包括基于PCR技術的擴增、基于MDA(multiple dilacement amplification)技術的擴增，以及將MDA與PCR技術相結合后的多次退火環狀擴增(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)技術。相比于前兩種擴增技術，MALBAC可以降低擴增偏倚性，提高測序覆蓋度，也可明顯提高單核苷酸多態性等位基因的檢出率，提高幅度為70%左右。Vitak等[15]報道了單細胞組合標記測序技術(single-cell combinatorial indexed sequencing, SCI-seq)，即多次對細胞進行條形碼編碼標記后再測序，該方法提高了單細胞測序的規模，不僅可用于體細胞變異核酸檢測，還可用于PDAC Ⅲ 期分析，確定胰腺癌亞克隆特定的拷貝數變異。

2017年，加拿大BC癌癥研究中心發明了DLP(direct library preparation)方法[16]，即用微流控設備獲得單細胞并裂解，在微小體積(μl)內直接加入標簽序列并打斷基因組，隨后通過PCR加入索引條形碼和測序接頭，完成單細胞文庫的制備，減少基于預擴增技術的偏差。2019年Laks等[17]對DLP技術進行了改進，研發出了具有更高準備度、可以構建高質量單細胞基因組文庫的DLP+技術，該技術不僅規避了擴增帶來的弊端，提高了規模化，而且保留了細胞及細胞核的圖像資料，同時展示了如何利用單細胞基因組測序數據鑒定克隆群體及其基因組特征和單個細胞的特征(復制狀態和染色體錯誤分離)以及基因組核形態學特征之間的關系，為研究單細胞的基因組提供了新的工具和資源庫。

隨著單細胞測序技術發展，在同一個單細胞中同時檢測基因組、轉錄組及蛋白質組，即單細胞多組學測序技術成為科學家關注焦點。2015年問世的DR-seq[18](DNA-mRNA sequencing)和G&t-seq[19](genomeand transcriptome sequencing)實現了對同一單細胞的轉錄組和基因組平行測序，DR-seq采取先逆轉錄、預擴增，再將產物一分為二的策略；G&t-seq則是利用生物素化的多聚T引物將mRNA率先從基因組DNA中分離。兩種組學信息的整合不僅能揭示基因組變異對基因表達水平的影響，還可對細胞基因組譜系樹作進一步的轉錄組注釋。2016年scTrio-seq(single-cell triple omics sequencing technique)技術[20]實現了同時分析單個細胞的基因組拷貝數變異(copy number variation, CVN)、DNA甲基化組和轉錄組學分析，基于基因組CVN信息可以檢測癌細胞亞群，基于三元組學信息推斷亞群的惡性程度和轉移潛能，適于研究細胞群體在發育和癌癥中的異質性。隨著單細胞測序技術的不斷更新和發展，其應用將會在解析細胞異質性、揭示微環境中細胞群體間的關系、追蹤疾病發生發展等研究中發揮更加重要的作用。

二、單細胞測序技術在胰腺癌異質性研究中的應用

在胰腺癌的臨床實踐中，大量分型、分級和分期相同的胰腺癌患者治療效果和預后顯著不同，這表明不同胰腺癌患者之間存在異質性。胰腺癌中PDAC占比達90%，為闡明PDAC之間的分子異質性，Zhao等[21]收集了1 200例PDAC患者整個轉錄組數據，通過回顧性Meta分析，將PDAC劃分為6種分子亞型，每種亞型都具有其特征的基因表達譜，表現出不同臨床特點，進而更好地分層PDAC患者，提供個性化治療。

此外，同一個體胰腺癌的癌細胞、腫瘤相關細胞之間也存在異質性。Peng等[22]對24例原發性PDAC和11例正常胰腺對照進行單細胞轉錄組測序，繪制了PDAC的單細胞轉錄組圖譜，對胰腺癌導管上皮細胞分型，發現高表達癌細胞惡性行為相關的亞群的增殖，往往伴隨著活化性T細胞的缺失，預示著較差預后。通過PDAC進展的擬時序分析， 觀察到2 299個基因存在動態變化，ERBB和Notch信號等通路中發生的多個關鍵調節因子和轉錄因子被激活并參與到PDAC的腫瘤形成過程，為揭示PDAC的瘤內異質性機制及疾病進展提供寶貴資源。

胰腺癌重要病理特征為間質纖維組織顯著增生，即大量腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)浸潤。Ligorio等[23]通過使用單細胞RNA測序技術和RNA原位雜交技術，對不同比例CAFs與PDAC細胞混合培養后得到的92個PDAC細胞進行測序，發現大量CAFs浸潤誘導PDAC細胞發生上皮間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)或者增殖特性(proliferative, PRO)轉變，從而具有更強的侵襲能力。對195個PDAC患者原位腫瘤組織的腫瘤芯片行ki67(標記EMT)和FN1(標記PRO)的RNA原位雜交(in situ hybridization, ISH)，分析了319 626個單細胞，將腫瘤腺體內含有的不同單細胞的種類和數量分為8類，其中高PRO以及高PRO和EMT細胞類型的患者生存期較短，從而清晰闡述了胰腺癌腫瘤內部結構，為揭示和研究胰腺癌異質性提供證據。

胰腺癌在不同患者、同一個患者不同癌細胞之間存在明顯的異質性。單細胞測序技術可以揭示組織內不同細胞，同一細胞不同階段的異質性。然而，由于PDAC的浸潤特性，間質占腫瘤腫塊的70%以上[24]，常嵌入正常胰腺組織，癌細胞占比小，且存在被蛋白酶降解的可能，胰腺癌樣本對單細胞測序提出了挑戰。隨著單細胞測序技術的發展，可解決特殊小樣本的研究、異質性亞群的分析、基因的功能富集、查找特異性標志基因，為胰腺癌發生、發展機制的深入研究提供有力技術支持。

三、單細胞測序技術在胰腺癌侵襲機制研究中的應用

胰腺癌的早期診斷困難，針對胰腺癌前病變進行單細胞測序研究，可以識別早期胰腺癌病變的潛在標志物。安德森癌癥中心分別選取來自2個低級別導管內乳頭狀黏液性腫瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN)(LGD-IPMN)、2個高級別IPMN(HGD-IPMN)和2個PDAC(均通過手術切除)的5 403個細胞進行單細胞RNA測序，揭示了從非侵襲性IPMN發展為侵襲性癌癥的過程中，上皮及腫瘤微環境發生的異質性改變。研究表明，即使在低級別的IPMNs中，也存在罕見細胞亞群具有侵襲性腫瘤轉錄特征的[25]。這種低頻細胞在LGD-IPMN中的表達譜可能在RNA測序過程中被忽略，進一步說明了單細胞測序方法在闡明胰腺癌前體的上皮細胞及微環境異質性是腫瘤進展早期事件中的優越性。

胰腺癌的高轉移特征是導致其預后差的重要原因[26]，約80%的胰腺癌患者伴有肝轉移，胰腺癌轉移相關基因表達也存在明顯的異質性。Law等[27]對56例胰腺癌肝轉移患者組織標本進行蛋白組學分析，根據其特點將胰腺癌分為4種亞型：代謝型、祖細胞類似型、增殖型和炎癥型。其中代謝型和祖細胞類似型患者采用FOLFIRINOX化療方案預后明顯好于吉西他濱化療組，而在增殖型和炎癥型患者中并無明顯差異，這一結果為確立胰腺癌肝轉移患者精準治療策略奠定基礎。基于單細胞蛋白組學水平的研究，可以對胰腺癌細胞轉錄后進行研究，檢測表達稀有的蛋白組和轉錄物水平，進一步映射胰腺癌中不同細胞亞群的類型和功能，對胰腺癌發生發展有更深層的認識。

在基因組和轉錄組水平上，加拿大安省癌癥研究所[28]從314例Ⅳ期胰腺癌患者取樣，使用激光捕捉纖維切割技術純化腫瘤樣本，得到330份全基因組測序數據和248份全轉錄組測序數據，獲得分子證據，將胰腺癌重新定義為基底樣A型、基底樣B型、混合型、典型性A型和典型性B型5類。典型性A型和B型腫瘤通常發生在胰腺癌早期；基底樣A型腫瘤表現出化療抗性和更高的致死率，在胰腺癌晚期的占比更高；基底樣B型和混合型通常表現為可切除的原位腫瘤。此外，該研究通過單細胞轉錄組測序發現同一個腫瘤中基底樣和典型胰腺癌細胞共同存在，兩者比例呈負相關；EMT過程與基底樣信號的表達呈正相關。提示基底樣信號與胰腺癌細胞轉移和浸潤的能力有關，證明新的分類的臨床意義，為評估胰腺癌預后奠定基礎。

四、單細胞測序技術在胰腺癌化療耐藥研究中的應用

化療是胰腺癌治療的主要手段之一，然而，耐藥是限制胰腺癌化療有效性的重要因素。CAFs在PDAC進展及化療耐藥性中發揮重要作用。CAFs在PDAC中形成一層很厚的結締組織，阻礙了化療藥物進入腫瘤。澳大利亞Garvan醫學研究所和Kinghorn癌癥中心的研究人員發現[29]，癌細胞可以分泌基底膜蛋白多糖，它是正常基質的重要成分，在基底膜蛋白多糖的作用下，CAFs形成了既能保護癌細胞，又能協助癌細胞轉移的環境。此外，降低基底膜蛋白多糖可以顯著提高胰腺癌組織對化療的反應性。Elyada等[30]采用單細胞RNA測序技術對人體和小鼠胰腺癌組織中腫瘤微環境成分進行分析，證實肌纖維母細胞CAFs和炎性CAFs的存在，并定義了其獨特的基因特征。同時描述了一群表達MHCⅡ分子和CD74但不表達經典共刺激分子的CAFs新群體，它們能以抗原特異性方式激活CD4+T細胞，從而發揮免疫調節作用。這一研究為認識PDAC中CAFs的異質性，并開發專門針對腫瘤間質中CAFs的靶向療法提供了新的理論基礎。

總之，單細胞測序技術發展迅速，但其在胰腺癌方面的應用仍處于起步階段，許多問題需要繼續探索。例如如何應用單細胞RNA測序評價胰腺癌一線化療藥物的治療效果，如何利用胰腺癌循環腫瘤細胞行單細胞測序從而實現早期診斷、篩選敏感藥物并預測預后等。相信隨著單細胞測序技術的不斷研發和改善，上述問題可獲得進一步研究和探索。

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