基于網絡藥理學的丹參治療哮喘作用機制初探△

李凡，劉久石，李斌，齊耀東，張本剛，劉海濤，肖培根

中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193

哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞等多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥[1]，具有氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑等特征[2]。其病理機制復雜、發病急、病程長、難以根治。尋找療效好且安全性好的藥物對于哮喘的治療十分重要。中醫藥治療哮喘歷史悠久、臨床療效良好、并發癥少且安全性好，在治療哮喘方面有獨特的優勢。

丹龍口服液是2017 年我國首個獲批上市的中藥新藥，也是我國實行藥品上市許可人制度后第一個獲批上市的中藥新藥[3]。該藥以中醫辨證論治為原則，由丹參、炙麻黃、地龍等組成[4]，是首個以丹參作為君藥治療哮喘的中成藥，表明丹參在治療哮喘方面具有重要功效。丹參用于肺部疾病治療早有研究，中西醫匯通學派的代表人物張錫純[5]在《醫學衷中參西錄》中提出，丹參配伍的中藥組方可治療肺癰等。現代藥理研究發現，丹參可通過腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導因子/成纖維細胞生長誘導因子14（TWEAK/Fn14）和轉化生長因子β1/Smads（TGF-β1/Smads）信號通路[6]、核轉錄因子-κB（NF-κB）通路[7]等改善卵白蛋白（OVA）誘導的小鼠哮喘炎癥。丹龍定喘湯可抑制哮喘小鼠血清中基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）的表達，改善氣道重塑[8]。臨床數據也顯示，采用丹參注射液聯合曲安奈德對支氣管哮喘急性發作期患者進行治療，總有效率達77%，治療效果較好[9]；使用丹參川芎嗪輔助治療支氣管哮喘30 例效果顯著，能有效減少支氣管哮喘復發[10]，提示丹參是治療哮喘的有效藥物。目前，丹參治療哮喘的藥效物質基礎及藥理作用機制尚不明確，本研究運用網絡藥理學方法構建丹參治療哮喘的藥物-成分-靶點-通路網絡，運用分子對接技術加以驗證，模擬化合物與靶點的相互作用，對結合模式和結合能力進行預測，研究關鍵靶點與丹參主要化學成分之間的相互作用，初步揭示丹參治療哮喘的活性成分、作用靶點和機制。

1 材料與方法

1.1 丹參活性成分及靶點篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[11]檢索丹參的化學成分，以藥動學中吸收、分布、代謝和排泄（ADME）屬性口服生物利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件[12-14]，對丹參成分進行初篩以獲得活性化合物，進一步獲取其對應的靶標蛋白。借助UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）進行靶點蛋白和基因信息校正，獲得丹參主要成分的預測靶點。

1.2 哮喘靶點篩選

以“asthma”作為檢索關鍵詞，利用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）、TTD（http://systemsdock.unit.Oist.jp/iddp/home/index）、DrugBank（http://www.drugbank.ca/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）數據庫收集哮喘靶點。在GeneCards 數據庫中取Score＞中位數的靶點作為哮喘的潛在靶點。合并疾病數據庫靶點，在UniProt 數據庫中校正基因信息，經過檢索和校對去重后確定哮喘的潛在靶點。

1.3 交集靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建

為明確丹參靶點與哮喘潛在靶點間的相互作用，運用R 語言將兩者靶點取交集，獲得丹參治療哮喘的靶點，提交至STRING 11.0 在線平臺（https://string-db.org/），選擇物種為“Homo sapiens”，設定聚類方法為“kmeans clustering”，運用Cytoscape 3.5.1分析得到PPI 網絡。運用Cytoscape 3.5.1 中的MCODE插件對網絡中各節點進行計算和分析，包括鄰節點子圖（neighbors）、密度（density）、以該點為種子節點所擴展出的最大值的K-core等信息，得到按照Score排序的4個功能模塊。運用CytoHubba篩選得到度（degree）值排名前10的關鍵靶點。

1.4 功能與通路的富集分析

基于Metascape在線平臺（https://metascape.org/gp/index.html）對丹參治療哮喘的靶點進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）及基因本體（GO）分析，運用R語言對結果進行可視化分析。

1.5 丹參成分-靶點-通路網絡的構建

將丹參活性成分、治療哮喘的靶點及信號通路導入Cytoscape 3.5.1 平臺，構建丹參成分-靶點-通路網絡。其中，丹參活性成分、靶點、信號通路在網絡中以節點（node）表示；各節點之間的相互關系以邊（edge）表示。

1.6 丹參治療哮喘關鍵靶點的分子對接驗證

運用分子對接技術模擬化合物與靶點的相互作用，對結合模式和結合能力進行預測。利用MOE 2019和PyMol 軟件對獲得的主要靶點和主要的活性成分進行分子對接，驗證關鍵靶點與丹參主要化學成分之間的相互作用。通過PDB 數據庫（https://www.rcsb.org）篩選靶點的蛋白晶體結構，選擇物種為“Homo sapiens”，實驗方法為“X-RAY DIFFRACTION”，高分子實體類型為“Protein”，選擇較低分辨率的蛋白晶體作為對接的模板。在PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中下載丹參活性成分的2D 結構（mol2 格式）。將靶點與活性成分導入MOE 2019 軟件，進行預處理和對接位點尋找，之后進行分子對接。運用R 語言繪制對接結果熱圖，用PyMol軟件顯示對接結果。

2 結果

2.1 丹參活性成分及靶點

通過TCMSP獲得丹參化學成分及對應的靶標蛋白，并運用UniProt數據庫將得到的靶標蛋白轉換為基因名。剔除無對應的靶點信息后，得到59 個潛在的活性成分（表1），進一步篩選得到其對應的135個可能靶點。

表1 丹參主要活性成分

續表1

2.2 哮喘靶點

從GeneCards 數據庫獲得哮喘靶點5974 個。設定Score＞中位數的目標靶點為哮喘的潛在靶點，其中Score 最大值為73.99，最小值為0.17，中位數為0.94，故設定Score≥0.94的靶點為哮喘的潛在靶點。剔除數據后，得到3298 個靶點。從OMIM、TTD、DrugBank、DisGeNET 數據庫中分別獲得哮喘靶點36、147、11、1312 個。合并所有哮喘靶點后刪除重復值，在UniProt平臺上校正疾病基因名，最終獲得3824個哮喘靶點。

2.3 交集靶點PPI網絡

將篩選的丹參成分靶點與哮喘靶點取交集，通過R 語言繪制韋恩圖，得到丹參成分-哮喘共同靶點108 個（圖1A）。將靶點提交至STRING 11.0 平臺，運用Cytoscape 3.5.1 軟件處理得到丹參靶點PPI 網絡（圖1B）。Jun、前列腺素E2（PTGS2）、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）、蛋白激酶B1（Akt1）、白細胞介素-6（IL-6）等結合分數都較高且度值較大，表明這些靶點可能在丹參治療哮喘中起關鍵作用。獲得PPI 網絡后，利用Cytoscape 3.5.1軟件中的MCODE 插件對相互作用關系進行聚類分析，得分值最高的子網絡，見圖1C。利用CytoHubba 插件得到按照度值排名前10 的關鍵基因（圖1D），依次為Akt1、表皮生長因子受體（EGFR）、Fos、IL-6、Jun、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、PTGS2、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤蛋白p53（TP53）、血管內皮生長因子A（VEGFA）。

圖1 丹參治療哮喘靶點PPI分析

2.4 靶點功能與通路的富集分析

將丹參治療哮喘的靶點信息導入Metascape平臺進行KEGG 信號通路分析和GO 分析，并用R 語言繪制結果圖（圖2）。依據P＜0.01、涉及靶點數量≥3、富集因子＞1.5，篩選出關鍵的20 條通路（圖2A）。結果顯示，丹參治療哮喘的靶點富集通路主要集中在磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt、NF-κB、Janus激酶-STAT（JAK-STAT）等通路，提示這些經典通路可能在丹參治療哮喘中發揮著重要作用。

設定相同的篩選條件得到GO 分析結果。GO 分析表明，丹參通過作用體內的多個位置和多種生物學過程發揮治療哮喘的作用。細胞組分（CC）分析表明，靶點的產物可能主要在細胞膜的功能筏（membrane raft）、突觸后膜（postsynaptic membrane）等部位（圖2B）；分子功能（MF）分析表明，靶點可能是通過G 蛋白偶聯胺受體（G protein-coupled amine receptor activity）、神經遞質受體的活動（neurotransmitter receptor activity）等發揮作用（圖2C）；生物學過程（BP）分析則提示，細胞因子介導的信號通路（cytokine-mediated signaling pathway）在丹參治療哮喘中比較重要（圖2D）。

圖2 丹參治療哮喘交集靶點的KEGG及GO分析（排名前20位）

2.5 藥物-成分-靶點-通路網絡

以上述得到的丹參治療哮喘的59 個潛在成分、108個交集靶點與20條關鍵通路為基礎，構建“network”與“type”文件，輸入至Cytoscape 3.5.1構建藥物-成分-靶點-通路網絡。如圖3所示，丹參通過59個成分、108個靶點、20條關鍵通路協同調控治療哮喘。

圖3 丹參治療哮喘的藥物-成分-靶點-通路網絡

2.6 分子對接驗證

將上述實驗篩選出的3 個主要活性成分木犀草素、丹參酮ⅡA、隱丹參酮與10 個關鍵靶點Akt1、EGFR、Fos、IL-6、Jun、MAPK1、PTGS2、TNF、TP53、VEGFA進行分子對接驗證。結果表明，參與分子對接化合物打分值均為負數（表2），打分值大多＜-5，表明化合物與關鍵靶點之間有較好的結合力。隱丹參酮可與PTGS2 的Tyr385、Ser530 2 個氨基酸殘基作用（圖4A），打分值為-7.382 5；丹參酮ⅡA與MAPK1 的Ile31、Met108、Asp106、Gln105殘基相互作用（圖4B），打分值為-5.408 9；木犀草素可以與EGFR（Met793、Gln791、Met790、Lys745、Asp837，圖 4C）和 PTGS2（Tyr385、Ser530，圖4D）相互作用，打分值分別為-7.167 1、-7.211 0。分子對接結果提示，丹參重要活性成分與疾病靶點生物親和力高，具有良好的活性。

圖4 丹參有效成分與靶點部分分子對接結果

表2 丹參有效成分與靶點對接打分

3 討論

本研究采用網絡藥理學的方法分析并探討丹參治療哮喘的活性成分、關鍵靶點和信號通路，并基于分子對接初步模擬其可能分子作用機制。氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的2 個主要病理學特征。本研究發現，丹參可通過影響氣道重塑和緩解氣道炎癥發揮治療哮喘的作用。丹參主要含脂溶性的丹參酮類及水溶性的黃酮類化合物[15]，本研究結果表明，丹參中59 個化學成分可通過作用于108 個靶點與20 條信號通路在治療哮喘發揮作用。隱丹參酮和丹參酮ⅡA均是丹參中主要的脂溶性丹參酮類成分，屬二萜醌類。隱丹參酮可降低哮喘小鼠氣道周圍炎性細胞浸潤和輔助性T 細胞2（Th2）細胞因子分泌，從而改善哮喘[16]。丹參酮ⅡA可降低血栓素B2等表達，緩解支氣管平滑肌收縮和血小板聚集，通過調節微循環障達到緩解哮喘的效果[17]。木犀草素是丹參中主要的黃酮類化合物，可抑制IL-4、IL-5、IL-13 等Th2 型細胞因子的合成，減少炎性細胞浸潤，減輕哮喘炎癥繼而緩解哮喘癥狀[18-19]。隱丹參酮、丹參酮ⅡA和木犀草素3 個化合物通過Akt1、EGFR、Jun、IL-6、Fos 等10 個關鍵靶點介導PI3KAkt、NF-κB、JAK-STAT 3 個關鍵通路參與調控哮喘（圖5）。

圖5 丹參治療哮喘的作用機制

PI3K-Akt 信號通路是與細胞內與磷脂酰肌醇有關的通路[20]，可參與調節哮喘。Akt1 是PI3K 直接作用的下游靶點，木犀草素可通過抑制Akt1 的磷酸化介導PI3K-Akt 信號通路，減少小鼠氣道平滑肌增殖從而緩解哮喘[21]。

NF-κB 通路被激活后可促進與哮喘有關的多種炎癥因子的基因轉錄，導致炎癥反應，誘發哮喘發病或加重哮喘癥狀。隱丹參酮可能通過TNF 等靶點影響NF-κB 抑制劑-α（NFKBIA）、p65 NF-κB 的磷酸化和TLR4 的表達而抑制NF-κB 通路，使肺組織中巨噬細胞和嗜中性粒細胞浸潤增加得到抑制，并減弱過氧化物酶（MPO）活性[22]。丹參酮ⅡA可通過NFKBIA 等抑制TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA 和蛋白的表達，通過抑制TLR4/NF-κB 通路減輕炎癥損傷，從而減輕哮喘炎癥[23]。

JAK-STAT通路是細胞因子受體介導的通路，被認為與支氣管哮喘有關[24-25]。IL-6 是支氣管哮喘的主要炎癥因子，哮喘急性發作時，IL-6 作用于B 細胞和T 細胞，促進免疫球蛋白E（IgE）生成[26]；IL-6與受體結合后也可活化JAK1，通過磷酸化STAT3，激活JAK-STAT 通路，引發炎癥反應，導致支氣管平滑肌痙攣和氣道炎癥。木犀草素等可降低IL-6 的表達，減少IgE 生成并進一步阻礙STAT3 活化，通過抑制JAK-STAT 通路達到改善肺部炎癥、緩解支氣管平滑肌痙攣、緩解哮喘的效果。

丹參中的丹參酮ⅡA和木犀草素還可通過降低肺組織中MMP-9 水平，減少大鼠肺組織炎性細胞浸潤，減輕支氣管管壁和平滑肌增生程度，改善氣道重建[27]。MMP-9 是與哮喘關系密切的基質金屬蛋白酶，可特異性降解細胞外基質，使其結構重建，同時誘導嗜酸粒細胞遷移并影響氣道平滑肌細胞增殖與遷移，進而誘發哮喘氣道重建。木犀草素還可抑制白細胞介素-13受體α2（IL-13Ra2）的表達，從而抑制氣道壁的增厚和平滑肌增殖，減輕氣道重塑[28]。此外，丹參酮ⅡA、木犀草素等還可通過下調哮喘肺組織中的Fos[29]、Jun[30]、EGFR[31]的表達以拮抗氣道重塑、調控氣道上皮細胞功能、改善氣道上皮細胞對損傷和修復、緩解哮喘氣道炎癥。

最后，分子對接結果顯示，木犀草素、隱丹參酮和丹參酮ⅡA與Akt1、EGFR 等關鍵靶點之間有較好的結合力，提示丹參重要活性成分與疾病靶點生物親和力強，在哮喘治療方面具有潛在的藥理活性。

4 結論

本研究利用網絡藥理學的方法構建丹參治療哮喘的成分-靶點-通路網絡，提示丹參通過多成分、多靶點、多通路的方式治療哮喘，并基于分子對接初步模擬其可能的分子作用機制。結果發現，丹參59 個潛在的有效成分通過108 個靶點、20 條主要通路發揮治療哮喘的作用。其中3 個重要化合物通過與10 個關鍵靶點相互作用，介導3 條重要通路在治療哮喘中發揮重要作用。隱丹參酮通過作用于TNF、TLR4 等靶點介導NF-κB 通路，減輕哮喘氣道炎癥；丹參酮ⅡA主要通過NFKBIA 等抑制TNF-α和NF-κB表達，進而抑制NF-κB 通路，減輕炎癥損傷和治療哮喘；木犀草素主要通過Akt1、IL-6 和STAT3 等靶點影響PI3K-Akt和JAK-STAT 通路，緩解氣道炎癥、改善氣道重塑和免疫調節來治療哮喘。最后通過分子對接驗證三者與疾病靶點生物親和力高，具有良好的藥效活性，為后續實驗研究提供參考。