基于網絡藥理學的地龍平喘作用機制研究△

馬韞楠，吳婭麗，鐘宛凌，汪文杰，楊萬青，張經緯，李鵬躍，杜守穎

北京中醫藥大學，北京 102488

地龍為鉅蚓科動物參環毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）、通俗環毛蚓P.vulgarisChen、威廉環毛蚓P.guillelmi（Michaelsen）或櫛盲環毛蚓P.pectiniferaMkhaeken的干燥體[1]。地龍始載于《神農百草經》，性寒，味咸，歸肝、脾、膀胱經，具有清熱止痙、平肝熄風、通經活絡、平喘利尿等功效。現代研究表明，地龍主要含有氨基酸、蛋白質和多肽、脂肪酸、核苷酸等成分，具有平喘、降壓、抗凝血、解熱鎮痛等藥理作用[2-3]。

支氣管哮喘簡稱哮喘，是由嗜酸粒細胞、肥大細胞、T 淋巴細胞、中性粒細胞等多種氣道炎性細胞，氣道上皮細胞、平滑肌細胞等結構細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病[4]。哮喘誘因較多，患者常出現可逆性氣流受限，并引起反復發作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等。目前臨床治療哮喘常用的藥物有抗膽堿能藥物、吸入型糖皮質激素、β2-受體激動劑、磷酸二酯酶抑制劑等[5]，但尚無法徹底治愈。哮喘屬于中醫學“哮病”范疇，基礎證候可分為外寒證、痰飲證、痰熱證、腎氣虛證等[4]。地龍是中醫臨床治療熱哮證哮喘的常用藥，其組方廣泛應用于小兒哮喘、咳嗽變異性哮喘、頑固性哮喘等疾病[6-9]。據統計，地龍在中國知網（CNKI）、萬方、維普、中國生物醫學文獻數據庫1988—2018 年治療哮喘有確切療效的1132 條方劑研究中出現470 次，頻次僅次于麻黃、甘草和苦杏仁[10]。地龍提取物已被證明對動物哮喘模型、離體支氣管平滑肌誘導收縮模型和炎癥細胞模型具有干預作用[11-12]，但其發揮藥效的物質基礎和作用機制尚不明確。

網絡藥理學融合了系統生物學、多向藥理學和計算機分析等多種技術，通過構建疾病-靶點-成分等相互作用網絡，能夠整體性、系統性、多層次地闡明藥物的作用機制，符合中藥多成分、多靶點、多途徑作用的特點，已成為中醫藥領域重要的研究方法[13]。本研究采用網絡藥理學結合動物實驗的方法，基于文獻調研結果和多種數據庫分析獲得了地龍化學成分干預哮喘的靶點和信號通路，構建了成分-靶點-通路相互作用網絡，綜合網絡分析和基因富集分析結果，對地龍平喘的物質基礎和作用機制進行了合理的推測，并采用豚鼠離體氣管平滑肌誘導收縮模型驗證了地龍提取物對膽堿能受體興奮導致的氣管平滑肌收縮的抑制作用，為地龍的藥理學研究提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

Hartley品系健康豚鼠，體質量300～350 g，由北京隆安實驗動物養殖中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0006。所有操作均符合北京中醫藥大學動物管理委員會相關倫理學要求（審批編號：2020102703）。

1.2 試藥

滬地龍藥材由云南永安制藥有限公司提供（批號：2020051101），經北京中醫藥大學杜守穎教授鑒定為通俗環毛蚓Pheretima vulgarisChen 的干燥體；鹽酸毛果蕓香堿（純度≥98%，批號：B28193）、氨茶堿（純度≥98%，批號：B24219）購于上海源葉生物科技有限公司；克-亨氏液為自制（取NaCl 6.9 g、KCl 0.35 g、KH2PO40.16 g、NaHCO32.1 g、CaCl20.28 g、葡萄糖2 g，超純水溶解至1 L，pH為7.4）。

1.3 儀器

JZJ01 型張力換能器、RM6240B 型多道生理信號采集處理系統（成都儀器廠）；ZRX-28952型麥氏浴槽（北京中瑞祥科技有限公司）。

2 方法

2.1 地龍化學成分的篩選和靶點預測

通過檢索CNKI（https://www.cnki.net/）、百鏈數據庫（http://www.blyun.com/）和PubMed 數據庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）中地龍化學成分研究的相關文獻[14-18]，收集地龍的化學成分，利用ChemDraw 軟件繪制各化合物的分子結構并保存為sdf（*.sdf）格式文件。

將地龍化學成分的sdf 格式文件上傳至SwissADME 平 臺（http://www.swissadme.ch/）[19]，篩選Pharmacokinetics 項下腸胃吸收（GI absorption）結果為“High”，并且Druglikeness 項下5 種類藥性預測（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）結果中有2 個及2 個以上為“Yes”的化合物作為具有較好口服生物利用度和類藥性的活性化合物。將活性化合物sdf 格式文件上傳至SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平臺[20]，物種選擇“Homo Sapiens”，以probability＞0為篩選條件，對化合物的潛在靶點進行預測，建立地龍活性成分-靶點數據庫。

2.2 哮喘疾病相關靶點預測

以“Asthma”“Bronchial Asthma”“Cough-Variant Asthma”為關鍵詞，檢索OMIM（https://omim.org/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）數據庫，將所收集的基因靶點去冗余，即為哮喘相關靶點。利用Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化處理。

2.3 地龍平喘作用靶點的篩選

將地龍活性化合物相關靶點與哮喘相關靶點利用Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）取交集，獲取地龍活性成分與哮喘疾病的共同靶點，即為地龍平喘的作用靶點。

2.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建及核心靶點篩選

將2.3 項下得到的交集靶點導入STRING 11.0數據庫（https://version-11-0.string-db.org/），“Organism”設為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設置為“High confidence（0.700）”，構建PPI 網絡。將PPI 網絡的tsv 文件導入Excel 表格，利用Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化處理，用Cytohubba插件計算評分篩選核心靶點。

2.5 基因富集分析

通過Metascape 數據庫（http://metascape.org/）對地龍平喘作用靶點進行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析。GO 分析設定閾值P＜0.05，選取生物過程（biological process，BP）中排名前20 的條目進行可視化。KEGG 分析設定閾值P＜0.05，將得到的信號通路進行可視化。根據KEGG分析結果，構建成分-靶點-通路網絡。

2.6 地龍提取物對離體氣管平滑肌收縮模型作用驗證

2.6.1 地龍提取物制備 取地龍藥材10 g，加純水40 mL勻漿2 min，8000 r·min-1離心10 min（離心半徑為13.5 cm），分離上清液作為提取物，每毫升提取物相當于地龍藥材0.25 g；采用Bradford 法測定提取物的蛋白含量。

2.6.2 豚鼠離體氣管平滑肌螺旋條標本的制備 豚鼠猛擊頭部處死后迅速取出氣管，浸沒于預熱至37 ℃、氧氣飽和的克-亨氏液中，小心剝離支氣管周圍組織，將其由一端向另一端剪成螺旋形條狀，寬2～3 mm，長3～4 cm。將制備的螺旋條置于盛有克-亨氏液的37 ℃恒溫通氧浴槽中，兩端用細繩結扎，一端系于浴槽底部固定鉤，另一端連接張力換能器。將生物信號采集系統與張力換能器連接，記錄平滑肌張力的變化，調節標本初始負載為1.0 g，穩定40 min后開始實驗。

2.6.3 地龍提取物對豚鼠離體氣管平滑肌張力的影響 待離體氣管平滑肌螺旋條張力穩定后，向培養液體積為22 mL 的浴槽中分別加入0.9%氯化鈉溶液、藥材終質量濃度為5.556 g·L-1的地龍提取物和終質量濃度為2.273 mg·L-1的毛果蕓香堿溶液，觀察藥物對正常狀態下離體氣管平滑肌張力的影響并記錄誘導后張力，每次誘導觀察后更換浴槽內的培養液。

待離體平滑肌張力穩定后，加入終質量濃度為2.273 mg·L-1的毛果蕓香堿溶液，誘導氣管平滑肌收縮，平滑肌收縮張力達到穩定后分別加入地龍提取物使恒溫浴槽中的地龍藥材質量濃度依次為2.273、5.556、10.870 g·L-1，陽性對照組加入終質量濃度為0.114 g·L-1的茶堿和0.9%氯化鈉溶液，每次加藥后更換浴槽內的培養液。記錄誘導收縮后平滑肌張力與給藥后平滑肌張力，按照公式（1）計算舒張率。實驗共重復6次。

2.6.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.3.0 軟件對數據進行統計學分析。所有數據用（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 地龍活性化合物靶點和疾病靶點預測

通過文獻檢索收集地龍中化合物，并通過SwissADME 平臺篩選獲得活性化合物71 個，包括氨基酸、脂肪酸（酯）、嘌呤和含氮化合物等其他小分子，通過SwissTargetPrediction 平臺預測并收集這些化合物的靶點，去重后得到化合物潛在靶點828個。檢索OMIM 和DrugBank數據庫，共收集疾病相關靶點145 個。將化合物潛在靶點與疾病相關靶點經Venny 2.1網站繪制韋恩圖（圖1）分析后，獲得2個靶點數據集的交集靶點，即地龍平喘的作用靶點67個，見表1。與共同靶點有映射關系的地龍平喘活性化合物共56個，見表2。

圖1 地龍化合物潛在靶點與哮喘靶點的韋恩圖

表1 地龍化合物與哮喘的共同靶點

表2 地龍潛在平喘活性成分

3.2 地龍平喘作用靶點的PPI網絡分析

將地龍平喘作用靶點導入STRING 11.0數據庫，查詢靶點的相互作用關系，通過Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化分析，獲得靶點PPI 網絡，見圖2。該PPI 網絡節點數為58，邊數為168，平均節點度值為6。通過CytoHubba 插件評估靶點蛋白質在PPI網絡中的連接作用程度，選取12 種算法排名前20的靶點中出現8 次以上的靶點為PPI 網絡中的核心靶點，共9 個，分別為細胞色素P450 3A4（CYP3A4）、細胞色素P450 1A1（CYP1A1）、UDP-葡萄糖醛酸轉移酶2B7（UGT2B7）、前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）、前列腺素E2受體EP2 亞型（PTGER2）、細胞色素P450 2C9（CYP2C9）、細胞色素P450 2C19（CYP2C19）、β2-腎上腺素受體（ADRB2）、細胞色素P450 1A2（CYP1A2）。

圖2 地龍平喘作用靶點PPI網絡

3.3 GO生物功能注釋和KEGG通路富集分析

GO 分析結果表明，地龍平喘作用的67 個潛在靶點能夠調控40 個生物學過程，包括血液循環（blood circulation）、花生四烯酸代謝過程（arachidonic acid metabolic process）、神經遞質水平調節（regulation of neurotransmitter levels）、化學突觸傳遞（chemical synaptic transmission）、腺苷受體信號通路（adenosine receptor signaling pathway）等，選取排名前15 的條目進行可視化，見圖3。該結果提示，地龍平喘活性化合物可以通過參與調控多種生物學過程而發揮作用。

圖3 地龍平喘作用靶點的GO生物過程分析

KEGG 通路富集分析表明，地龍平喘作用靶點主要參與15 條信號通路的調控，包括膽堿能突觸（cholinergic synapse）、神經活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、環磷酸腺苷信號通路（cAMP signaling pathway）、色氨酸代謝（tryptophan metabolism）等，將結果進行可視化，見表3。

表3 地龍平喘作用靶點的KEGG通路富集分析

3.4 成分-靶點-通路網絡的構建

結合地龍平喘活性化合物-靶點數據庫與KEGG分析的信號通路結果，通過Cytoscape 3.7.1 軟件構建成分-靶點-通路網絡，見圖4。該網絡包含138 個節點、530 條邊，其中地龍平喘活性成分56 個，作用靶點67個，信號通路15條。分析結果顯示，地龍中化合物分子的平均度值為8，氨基酸、脂肪酸（酯）、核苷酸、含氮化合物等其他分子的平均度值分別為2、13、5 和7，度值最高的化合物是肉豆蔻烯酸和9-十四碳烯酸，度值均為23。

圖4 地龍平喘作用的成分-靶點-通路網絡

該網絡中，靶點的化合物-靶點映射平均度值為6，度值最高的靶點為皮質類固醇11-β-脫氫酶同工酶1（HSD11B1），度值為22。其他度值較高的靶點還有糖皮質激素結合球蛋白（SERPINA6）、腺苷受體A3（ADORA3）、PTGER2、HSD11B2、PTGS2等。

3.5 地龍提取物對離體氣管平滑肌收縮模型作用驗證

3.5.1 地龍提取物制備 按2.6.1 項下方法平行制備3 批地龍提取物，通過Bradford 法測定3 批提取物的蛋白質量濃度為（1.308±0.004）mg·mL-1，RSD為0.32%，說明通過該方法制備的地龍提取物的蛋白含量較穩定。

3.5.2 地龍提取物對豚鼠離體氣管平滑肌張力的影響 由實驗結果可知，2.273 mg·L-1的毛果蕓香堿溶液能夠較好地引起豚鼠離體氣管平滑肌螺旋條的收縮，使氣管平滑肌張力顯著上升。與0.9%氯化鈉溶液對照組比較，地龍提取物5.556 g·L-1對正常狀態下的離體氣管平滑肌張力無明顯影響。與0.9%氯化鈉溶液對照組比較，陽性藥氨茶堿能顯著抑制毛果蕓香堿誘導產生的收縮作用，使氣管平滑肌張力下降；質量濃度為2.273、5.556、10.870 g·L-1的地龍提取物均能不同程度地抑制毛果蕓香堿引起的氣管平滑肌收縮，且舒張率與質量濃度呈正相關，見表4。0.9%氯化鈉溶液、氨茶堿及不同質量濃度的地龍提取物對毛果蕓香堿誘導的氣管平滑肌收縮的影響見圖5。

圖5 不同質量濃度地龍提取物對毛果蕓香堿誘導的氣管平滑肌收縮的影響

表4 地龍提取物對毛果蕓香堿誘導豚鼠離體氣管平滑肌收縮模型的作用（,n=6）

表4 地龍提取物對毛果蕓香堿誘導豚鼠離體氣管平滑肌收縮模型的作用（,n=6）

注：藥物對正常離體氣管平滑肌的影響與0.9%氯化鈉溶液對照組比較，△△△P＜0.001；藥物對毛果蕓香堿誘導離體氣管收縮模型的影響與0.9%氯化鈉溶液對照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001。

4 討論

地龍的化學成分種類繁多，作用機制復雜。本研究構建了地龍治療哮喘的化合物-靶點-通路網絡，通過Cytoscape 3.7.1 軟件對地龍活性成分的度值分析得出，脂肪酸（酯）的平均度值最高，脂肪酸類成分作用的靶點共55 個，占研究靶點總數的82.1%，并且該55 個作用靶點覆蓋了KEGG 富集的15 條通路。該結果表明，地龍中脂肪酸類成分可能通過多種途徑干預疾病，產生平喘作用。地龍含多種不飽和脂肪酸如α-亞麻酸等。ω-3 多不飽和脂肪酸可以通過抑制核轉錄因子-κB（NF-κB）活化等多種機制調控機體的炎癥反應和免疫功能[21]。研究證明，急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）治療中加用ω-3多不飽和脂肪酸可對患者機體的免疫功能和炎癥反應起到一定的調節作用，并改善氣體交換能力[22]。周明眉等[23]證明了地龍酸性部位可降低過敏性哮喘模型小鼠支氣管灌洗液（BALF）中的嗜酸性粒細胞（EOS）水平，調整細胞因子輔助性T 細胞1 型細胞因子/輔助性T 細胞2 型細胞因子（Th1/Th2）平衡，起到抗炎和抗過敏作用。褚襄萍[12]通過實驗證明，地龍酸性部位為平喘活性部位，共鑒定出該酸性部位含有的12 種脂肪酸；并且發現，酸性部位中去除脂肪酸類中低極性成分后，剩余的高極性成分降低哮喘小鼠BALF中EOS細胞數量的作用減弱，說明地龍脂肪酸對哮喘過程中炎癥細胞水平有潛在的負調節作用。

目前文獻報道中認為，次黃嘌呤可能是地龍平喘的重要活性成分之一。劉君怡[24]用含5%～20%甲醇的乙酸乙酯提取地龍平喘活性部位并進行了分離，得到了主要成分為核苷類（包括次黃嘌呤）的流分，并證明該流分可能通過抑制白三烯B4（LTB4）水平、促進Th1 細胞分泌γ-干擾素（IFN-γ）和Th2 細胞凋亡，改善平滑肌收縮并調節患者機體的免疫平衡，進而發揮平喘作用。本研究中次黃嘌呤的作用靶點包括乙酰膽堿酯酶（ACHE）和腺苷受體（ADORA）家族。

本研究中氨基酸的平均度值水平較低，但地龍中氨基酸的含量較高，對地龍的平喘作用可能有較大的貢獻。KEGG 分析結果顯示，地龍平喘作用可能與色氨酸代謝通路有關，脂肪酸、次黃嘌呤、含氮化合物等多種小分子參與了該通路的調節。色氨酸代謝產物有助于特異性免疫治療減輕氣道炎癥作用，其機制與調控Th17 及調節性T 細胞（Treg）分化有關[25]。褚襄萍[12]從地龍平喘活性部位中分離出了主要成分為氨基酸的高極性部位，實驗證明，該部位降低哮喘模型小鼠BALF上清液中免疫球蛋白E（IgE）、白細胞介素-4（IL-4）、IL-5、IL-13 水平的作用和總活性部位相比差異無統計學意義，故推斷氨基酸可能是地龍發揮平喘作用的物質基礎。此外，地龍中的一些含氮類化合物如4-（辛烷氧基）苯胺、二氫辣椒素和花生四烯酰胺等在本研究中具有較高的度值，可能與地龍其他成分共同發揮平喘作用。

哮喘是由多種細胞和細胞因子參與的氣道炎癥及氣道高反應性（AHR）疾病，氣道炎癥是哮喘AHR 的基礎，無論過敏性還是非過敏性哮喘氣道炎癥都以EOS 浸潤和激活為最終共同途徑[26]?；ㄉ南┧幔ˋA）的生化代謝過程與炎癥反應密切相關，其代謝產物白三烯（LT）和前列腺素（PG）是一類活性較強的炎癥介質，可誘導免疫系統產生連鎖反應，造成支氣管痙攣，增加血管通透性，引起氣道的水腫[27]。GO 生物過程分析結果顯示，地龍活性化合物可通過花生四烯酸-5-脂加氧酶（ALOX5）、PTGS1、PTGS2 等靶點調節AA 代謝過程，推測該過程的調節是地龍提取物抑制哮喘模型動物BALF中EOS水平的主要途徑之一。KEGG分析結果表明，地龍中的化合物可調節免疫細胞FcεRI 受體信號通路，該通路與對NF-κB 信號通路的激活密切相關[28]，廣地龍可通過抑制NF-κB活化產生抗炎活性[11]。

膽堿能神經通過釋放乙酰膽堿作用于氣道內各效應細胞上的M1 和M3 型膽堿能受體而產生興奮作用，從而導致氣道平滑肌收縮[29]。KEGG 分析結果顯示，地龍的平喘作用可能與膽堿能神經突觸（cholinergic synapse）信號通路有關，涉及靶點為乙酰膽堿酯酶（ACHE）和毒蕈堿型乙酰膽堿受體（CHRM）家族。本研究通過設計離體氣管誘導收縮模型實驗，驗證了地龍提取物對于膽堿能受體興奮引起的氣管平滑肌收縮的舒張作用。離體氣管法是一種常用的篩選平喘藥的實驗方法，具有快速、方便、經濟的特點，并可直接觀察到藥物對氣管平滑肌的收縮和舒張作用[30]。毛果蕓香堿是一種膽堿能受體激動劑，通過作用于氣管平滑肌上分布的M 型膽堿受體導致氣管平滑肌收縮。實驗結果顯示，不同質量濃度的地龍提取物能不同程度地抑制膽堿能神經興奮引起的氣管平滑肌收縮，該研究結果表明，地龍的平喘作用可能與膽堿能受體信號通路有關。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學方法初步研究了地龍平喘的活性成分、靶點和信號通路，發現地龍與平喘作用相關的活性化合物56 個、作用靶點67個、相關通路15條，討論了脂肪酸、核苷酸、氨基酸和含氮分子等其他化合物調節AA 代謝過程、FcεRI 信號通路、膽堿能神經突觸信號通路、色氨酸代謝通路與發揮平喘作用的關系，驗證了地龍提取物對膽堿能受體興奮造成的離體氣管平滑肌收縮的舒張作用，說明地龍發揮平喘作用具有多成分、多靶點、多途徑作用的特點。本研究從網絡藥理學角度闡釋了地龍的活性成分、靶點及相關信號通路和生物過程，為地龍平喘作用的藥效基礎研究提供了參考。