厚樸花浸出物測定方法的建立與不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量評價△

干麗，洪婉敏，田甜，李燕珍，夏長青，孫冬梅

廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244

厚樸花為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹葉厚樸M.officinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥花蕾，其味辛、苦，性微溫，歸肺、大腸經(jīng)，具有芳香化濕、理氣和中等功效，主要用于行氣消脹、下氣平喘、胸膈脹悶、燥熱健脾等[1]。主產(chǎn)于湖北、四川等地的厚樸花習(xí)稱為“川樸花”，主產(chǎn)于浙江、福建等地的凹葉厚樸花習(xí)稱為“溫樸花”[2]。厚樸花的主要成分有厚樸酚、和厚樸酚、揮發(fā)油及木蘭箭毒堿等[3-4]。研究表明，厚樸花具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌等多種藥理作用[5-7]，厚樸酚、和厚樸酚是其發(fā)揮藥理作用的主要活性成分，厚樸花藥材的質(zhì)量優(yōu)劣也多以厚樸酚、和厚樸酚含量為指標(biāo)。與厚樸花基原相同但入藥部位不同的厚樸在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中具有廣泛且重要的作用，但厚樸樹皮生長期限過長，一般采割年限在15 年以上，因此，與厚樸主要成分相同且生長期限短的厚樸花成為近年來的研究熱點。隨著厚樸花的廣泛應(yīng)用，如何評價厚樸花藥材的質(zhì)量成為一個亟待解決的問題。

《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版一部厚樸花項下僅有厚樸酚、和厚樸酚的含量測定，無浸出物檢查要求，而浸出物是藥材質(zhì)量評價的主要依據(jù)之一。張雪等[8]對臨床處方中應(yīng)用頻率最高的80 味中藥飲片進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，超過50%的飲片建立了浸出物與含量測定指標(biāo)。故本實驗基于厚樸花超高效液相色譜法（UPLC）特征圖譜建立浸出物的測定方法，并篩選厚樸花的最佳藥材產(chǎn)地，為厚樸花藥材的質(zhì)量評價、資源開發(fā)利用及生產(chǎn)加工提供參考。

1 材料

1.1 儀器

賽默飛Vanquish 型超高效液相色譜儀，系列可變波長檢測器（VWD）；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）；ME204E 型萬分之一天平（Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥

對照品厚樸酚（批號：110729-201714，純度：100%）、和厚樸酚（批號：110730-201614，純度：99.3%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙醇（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，默克股份有限公司）；水（Milli-Q Direct超純水）。

11 批厚樸花藥材來源信息見表1，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.的干燥花蕾，且各指標(biāo)均符合《中國藥典》2020年版的要求。

表1 厚樸花樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～3 min，8%A；3～19 min，8%～12%A；19～28 min，12%～20%A；28～34 min，20%～38%A；34～39 min，38%～58%A；39～49 min，58%A；49～50 min，58%～8%A；50～55 min，8%A）；柱溫：30 ℃；流速：0.35 mL·min-1；檢測波長：300 nm：進樣量：1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取厚樸酚、和厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成分別含厚樸酚357.25 μg·mL-1、和厚樸酚303.95 μg·mL-1的混合對照品溶液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 厚樸花藥材過三號篩，精密稱定1.0 g 粉末，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，回流提取60 min，放冷，稱定質(zhì)量，用75%乙醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾液以0.22 μm微孔濾膜濾過，供檢測分析用。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取75%乙醇，用0.22 μm微孔濾膜濾過，作為陰性對照溶液。

2.3 特征圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 取同一批厚樸花樣品（批號：G1807148），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以和厚樸酚為參照峰，計算圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰相對保留時間RSD 為0.004%～0.237%，各共有峰相對峰面積RSD為0.127%～0.982%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批厚樸花樣品（批號：G1807148），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10 h 進樣并記錄色譜圖。以和厚樸酚為參照峰，計算特征圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD 為0.011%～0.739%，各共有峰的相對峰面積的RSD為0.318%～1.482%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取同一批厚樸花樣品6 份（批號：G1807148），按2.2.2 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以和厚樸酚為參照峰，計算特征圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰相對保留時間RSD 為0.002%～0.171%，各共有峰相對峰面積RSD為0.163%～1.560%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 特征圖譜的建立 取10 批厚樸花藥材，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件測定，記錄色譜圖，使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”2012A版進行共有峰匹配，以S1厚樸花的色譜圖為參照圖譜，將時間窗寬度設(shè)為0.1 min，采用多點校正法進行色譜峰匹配，選擇中位數(shù)法生成對照圖譜R，10 批厚樸花的UPLC 疊加特征圖譜見圖1。以厚樸花對照圖譜R為參照，進行整體相似度評價，10 批厚樸花相似度均大于0.8，結(jié)果表明各批藥材與對照特征圖譜R具有較好的一致性。

圖1 厚樸花的UPLC疊加特征圖譜及對照圖譜

2.4 含量測定

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取厚樸酚對照品母液及和厚樸酚對照品母液各0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，按2.1 項下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。厚樸酚回歸方程為Y=0.046 3X+0.068 9（r=1.000 0），線性范圍為17.86～357.25 μg·mL-1；和厚樸酚回歸方程為Y=0.059 0X+0.050 4（r=1.000 0），線性范圍為15.20～303.95 μg·mL-1。表明厚皮酚、和厚樸酚在以上范圍內(nèi)進樣質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗 取線性考察中同一質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按2.1項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果厚皮酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為0.181%、0.102%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批厚樸花樣品（批號：G1807148），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10 h 進樣并記錄色譜圖。結(jié)果厚皮酚、和厚樸酚含量的RSD分別為0.297%、0.376%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一批厚樸花樣品6 份（批號：G1807148），按2.2.2 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果厚皮酚、和厚樸酚含量的RSD 分別為0.345%、0.423%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 專屬性試驗 分別吸取上述對照品、供試品及陰性對照等溶液，按2.1 項下色譜條件進樣，陰性對照溶液在厚樸酚與和厚樸酚色譜峰位置無吸收，說明陰性對照溶液無干擾，見圖2。

圖2 厚樸花樣品與對照品HPLC圖

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知含量的厚樸花藥材9 份（批號：G1807148），精密稱定，每組3 份，按對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比0.5∶1.0、1∶1、1.5∶1.0 加入厚樸酚與和厚樸酚對照品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，計算加樣回收率，回收率為91.84%～104.17%，表明回收率良好。見表2。

表2 和厚樸酚和厚樸酚加樣回收率試驗結(jié)果

2.5 浸出物提取方法

2.5.1 供試品溶液的制備 冷浸法：稱取厚樸花藥材（批號：G1812022）12 份，每份約4 g，分別加入水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇100 mL（每種溶劑平行測定3 份）；熱浸法同上，按照《中國藥典》2020 年版通則2201 項下浸出物測定，依次計算浸出物的含量。取冷浸法與熱浸法續(xù)濾液適量，濾液以0.22 μm微孔濾膜濾過，供UPLC檢測分析用。

2.5.2 不同提取方法對厚樸花浸出物含量的影響 精密量取2.5.1項下浸出物樣品溶液25 mL，分別置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，以干燥品計算供試品中浸出物含量。結(jié)果見表3。采用熱浸法提取厚樸花浸出物的含量在任何提取溶劑下都高于冷浸法提取所得的浸出物，在不同溶劑中熱浸法提取的浸出物的含量順序為水＞50%乙醇＞75%乙醇＞95%乙醇。

表3 厚樸花不同提取方法浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3） %

表3 厚樸花不同提取方法浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3） %

2.5.3 不同提取方法對厚樸花浸出物特征圖譜與厚樸酚、和厚樸酚含量的影響 不同提取方法提取厚樸花浸出物色譜圖見圖3，對應(yīng)的厚樸酚與和厚樸酚總含量見表4，總峰面積見表5。

表5 厚樸花不同提取方法總峰面積（,n=3）

表5 厚樸花不同提取方法總峰面積（,n=3）

圖3 厚樸花樣品不同提取方法的特征圖譜

表4 不同提取方法厚樸酚與和厚樸酚總質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3） %

表4 不同提取方法厚樸酚與和厚樸酚總質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3） %

結(jié)果表明，水溶性浸出物中無法檢測出厚樸酚與和厚樸酚。不同溶劑下熱浸法提取厚樸酚與和厚樸酚總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于冷浸法，且熱浸法提取以75%乙醇提取所得厚樸酚與和厚樸酚總質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。不同溶劑熱浸法提取總峰面積均大于冷浸法，也以75%乙醇熱浸法提取的總峰面積最大。

2.5.4 層次分析法確定浸出物提取工藝各指標(biāo)權(quán)重系數(shù) 以浸出物的含量、厚樸酚與和厚樸酚總含量、共有峰總峰面積為評價指標(biāo)，對厚樸花浸出物提取工藝進行目標(biāo)樹構(gòu)建[9]。對同一層次目標(biāo)的相對重要性，按評分標(biāo)準(zhǔn)表進行比較[9]，并構(gòu)成厚樸花浸出物的3 個指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣。其中，厚樸酚與和厚樸酚總含量∶浸出物含量為2∶1，共有峰總峰面積∶浸出物含量為1∶1。按公式（1）計算初始權(quán)重系數(shù)Wi′。

式中，i為評價指標(biāo)，i=1、2…m，m為檢驗層次目標(biāo)數(shù)，a1～am為矩陣兩兩比較的評分。

經(jīng)計算，浸出物含量、厚樸酚與和厚樸酚總含量、特征峰總峰面積3 個指標(biāo)成分初始權(quán)重系數(shù)分別為=1.259 9、W2′=0.630 0、=1.259 9。按公式（2）計算歸一化權(quán)重系數(shù)Wi。

經(jīng)計算，浸出物含量、厚樸酚與和厚樸酚總含量、特征峰總峰面積3 個指標(biāo)成分權(quán)重系數(shù)分別為W1=0.400、W2=0.200、W3=0.400。

按照公式（3）～（5）對權(quán)重系數(shù)進行一致性檢驗。

式中，CR 為隨機一致性比率；CI 為一致性指標(biāo)；RI 為隨機一致性指標(biāo)，其數(shù)值根據(jù)判斷矩陣的階數(shù)通過查表獲得；m為受檢驗層次目標(biāo)數(shù)；λmax為矩陣的最大特征根，其中，當(dāng)CR=0時，判斷矩陣A具有完全一致性；當(dāng)CR＜0.1時，判斷矩陣A具有滿意一致性；當(dāng)CR＞0.1時，判斷矩陣A不具有一致性。

經(jīng)計算，λmax=3.000，則CI=0，CR=0。因此3項指標(biāo)優(yōu)先比較矩陣滿足一致性要求，故所得W1=0.400、W2=0.200、W3=0.400 權(quán)重系數(shù)有效，結(jié)果具有準(zhǔn)確性。

2.5.5 基于層次分析法的厚樸花浸出物不同提取方法綜合評價 通過層次分析法確定浸出物含量、厚樸酚與和厚樸酚總含量、共有峰總峰面積的權(quán)重比例為0.4∶0.2∶0.4，進一步采用公式（6）計算加權(quán)綜合評分，對提取工藝進行優(yōu)選，結(jié)果見表6。

表6 厚樸花浸出物提取方法加權(quán)評分

不同溶劑下熱浸法提取加權(quán)總得分明顯高于冷浸法，以75%乙醇為溶劑熱浸法提取時加權(quán)總得分最高，故確定厚樸花浸出物最佳提取方法為以75%乙醇為溶劑采用熱浸法提取。

2.6 不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量評價

取不同產(chǎn)地的10 批厚樸花藥材（S1～S10），采用最佳工藝熱浸法75%乙醇水提取制備供試品，測定浸出物含量、厚樸酚與和厚樸酚總含量與特征峰總峰面積。結(jié)果見表7。對不同產(chǎn)地厚樸花藥材進行質(zhì)量分析，使用SPSS 22.0 對浸出物含量、厚樸酚與和厚樸酚總含量、共有峰總峰面積進行方差分析，采用單因素ANOVA 分析進行組間比較，P＜0.05 認為具有差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見表8。

表7 不同產(chǎn)地厚樸花浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、總峰面積及厚樸酚與和厚樸酚總質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表8可知，不同產(chǎn)地厚樸花浸出物含量存在差異，其中湖北產(chǎn)厚樸花浸出物含量與四川、浙江產(chǎn)厚樸花浸出物含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而四川、浙江產(chǎn)厚樸花浸出物含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，浸出物含量與產(chǎn)地關(guān)系為四川省＞浙江省＞湖北省。不同產(chǎn)地間厚樸酚與和厚樸酚總含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。多重比較結(jié)果表明，四川省與浙江省的厚樸花共有峰總峰面積的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），來源于四川省的厚樸花共有峰總峰面積高于來源于浙江省的。綜上分析，以浸出物含量、厚樸酚與和厚樸酚總含量、共有峰總峰面積為評價指標(biāo)時，四川省產(chǎn)出的厚樸花質(zhì)量優(yōu)于湖北省與浙江省。

表8 不同產(chǎn)地厚樸花藥材質(zhì)量差異性分析（,n=3）

表8 不同產(chǎn)地厚樸花藥材質(zhì)量差異性分析（,n=3）

注：同列不同大寫字母表示P＜0.01；同列不同小寫字母表示P＜0.05。

3 討論

浸出物含量測定是浸出物質(zhì)量檢測的手段之一，厚樸酚與和厚樸酚含量是厚樸花質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。由于中藥成分與治療機制較復(fù)雜，本實驗將浸出物含量、厚樸酚與和厚樸酚總含量、厚樸花特征圖譜中12 個主要共有峰（包括厚樸酚與和厚樸酚）的總峰面積作為考察指標(biāo)，以層次分析法確定各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，采用加權(quán)綜合評分法優(yōu)化提取工藝使浸出物的提取方法更具有科學(xué)性。結(jié)果表明，厚樸花浸出物的最佳提取工藝為熱浸法75%乙醇提取，與相關(guān)研究結(jié)果一致：厚樸酚與和厚樸酚均為酚類結(jié)構(gòu)，其水溶性極差，很難溶出，但其易溶于乙醇[9]。

不同產(chǎn)地厚樸花浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.28%～24.36%，均值為20.42%，實驗結(jié)果可為厚樸花浸出物含量的限度提供參考，鑒于不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量的波動，可制定浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值的70%為厚樸花浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下限，即浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于14%。

浸出物含量、厚樸酚與和厚樸酚總含量、共有峰總峰面積均以四川省產(chǎn)地的厚樸花最高，其中浸出物含量明顯高于湖北省與浙江省，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。習(xí)慣認為川樸花質(zhì)量較佳[2]，本研究結(jié)果為該觀點提供了實驗證明，也為厚樸花藥材的質(zhì)量控制、藥材質(zhì)量評價提供參考。