不同干燥方法對苦地丁藥材品質(zhì)的影響△

王圓圓，李超，谷巍，巢建國*，毛春芳，王凱，惠西珂

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210000；2.濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 泰興 225400；3.江蘇省南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 南通 226000

苦地丁為罌粟科紫堇屬植物地丁草Corydalis bungeanaTurcz.的干燥全草[1]，始載于《中藥志》，別名地丁[2]，味苦，性寒，具有清熱解毒、散結(jié)消腫的功效[1]，可用于治療流行性感冒、上呼吸道感染、扁桃體炎、肺炎等[3]。近年來，河北安國苦地丁的種植面積不斷擴(kuò)大，產(chǎn)地初加工方式影響藥材品質(zhì)的問題日益突出。干燥是藥材加工的第一步，也是保障中藥材品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。經(jīng)過干燥后的藥材不易腐敗變質(zhì)。中藥成分及其藥理活性復(fù)雜，不同的干燥方法會導(dǎo)致成分發(fā)生變化[4-5]。傳統(tǒng)的曬干法成本低但受光照、溫度、濕度等外界因素影響較大。陰干法時間較長、容易生霉，導(dǎo)致苦地丁藥材品質(zhì)下降。因此，有必要開展苦地丁藥材干燥方法的研究。本研究以新鮮地丁草為原材料，對曬干、陰干、真空干燥、微波干燥、鼓風(fēng)干燥5 種干燥方式進(jìn)行研究。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苦地丁含有生物堿類、黃酮類、糖類、氨基酸等化學(xué)成分[6]，前人多采用高效液相色譜法對苦地丁生物堿類成分進(jìn)行分析[7]，很難對藥材品質(zhì)進(jìn)行綜合評價。為了高效快速鑒定苦地丁的化學(xué)成分，本研究采用高效液相色譜-三重四極桿飛行時間質(zhì)譜法（HPLC-Triple-TOF-MS/MS）對苦地丁成分定性分析，找出差異化學(xué)成分，通過主成分分析及聚類分析對不同干燥方法的苦地丁藥材相對含量進(jìn)行綜合分析，結(jié)合干燥時間及能耗找出適宜的干燥方法，為苦地丁藥材科學(xué)生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料

1260 型高效液相色譜儀、G6500 系列四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）；ME36S 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；KQ-500B 型超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水制備儀（美國Millipore 公司）；Pmb53 型快速水分測定儀（德國Adam 公司）；Q-500B型高速多功能粉碎機(jī)（上海冰都電器有限公司）；DHG-9023A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；2012 型高速臺式離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；COWB-4型工業(yè)微波爐（江陰辰歐微波能系統(tǒng)設(shè)備有限公司）。

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純（德國默克公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

地丁草于2020 年5 月7 日采自河北省安國市段村鄉(xiāng)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)巢建國教授鑒定為地丁草Corydalis bungeanaTurcz.全草。

2 方法

2.1 樣品干燥

取地丁草鮮品，混合均勻，隨機(jī)分成11 份，每份約1 kg，按表1 所示加工方法進(jìn)行干燥，當(dāng)含水率達(dá)到13.0%時，停止干燥并留樣。

表1 苦地丁干燥樣品信息

2.2 色譜條件

安捷倫ZORBAX Extend-C18RRHT 色譜柱（50 mm×2.01 mm，1.8 μm）；以0.1% 甲酸水（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫（0～3 min，2%B；3～4 min，2%～5%B；4～7 min，5%～13%B；7～27 min，13%～30%B；27～61 min，30%～90%B；61～63 min，90%B）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為3 μL；樣品室溫度為8 ℃。

2.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），在正離子模式下進(jìn)行分析，干燥氣溫度為325 ℃；霧化器壓力為35 psi（1 psi=6.895 kPa）；毛細(xì)管出口電壓為110 V；干燥器體積流量為8 L·min-1；毛細(xì)管電壓為4000 V；質(zhì)量掃描范圍m/z50～2000；儀器掃描模式為4 GHz、高分辨模式。通過Agilent MassHunter LC/MS Data acquisition B.5.01 軟件同時采集樣品的輪廓圖和柱狀圖數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集前使用Agilent ESI-L 調(diào)諧液對儀器進(jìn)行調(diào)諧和質(zhì)量軸校正。

2.4 供試品溶液的制備

精密稱定樣品粉末1 g（過三號篩），置于50 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醇30 mL，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）60 min，冷卻，70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，以12 000 r·min-1（離心半徑為5.8 cm）離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.5 質(zhì)量控制（QC）樣品的制備

取2.4 項(xiàng)下的所有供試品溶液各1 mL 混合均勻，作為QC 樣品，按2.2 和2.3 項(xiàng)下條件，在所有樣品數(shù)據(jù)采集前和采集后及每3 個樣品數(shù)據(jù)之間各進(jìn)行1次QC樣品的數(shù)據(jù)采集。

2.6 數(shù)據(jù)分析

每個樣品平行分析2 次后，使用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.06.00 軟件查看QC 樣品的數(shù)據(jù)，查看保留時間及響應(yīng)值的變化；采用MS-DIAL ver 4.18 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理獲得解卷積譜圖，通過數(shù)據(jù)庫匹配作為化合物鑒定的先決條件，用MS-FINDER ver 3.44 通過其元素分子式和電離質(zhì)譜碎片來注釋未知化合物，使用SPSS 20.0、MetaboAnalyst 5.0 對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分及聚類分析。

3 結(jié)果

3.1 定性結(jié)果分析

按照上述液相色譜和質(zhì)譜條件對苦地丁樣品進(jìn)行分析，由于基峰離子流圖（BPC）在正離子模式下色譜峰比較豐富（圖1），本研究采用正離子的全掃描檢測模式對不同干燥方法苦地丁的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。每種干燥方法的苦地丁藥材均鑒定到了37 個化合物，包括生物堿類成分24 個（1～24）、黃酮類成分2 個（25～26）、氨基酸類成分11 個（27～37），鑒定化合物的相關(guān)信息見表2。

圖1 苦地丁藥材樣品離子流圖

表2 苦地丁化學(xué)成分鑒定結(jié)果

續(xù)表2

3.2 聚類分析

聚類分析是將樣品按照其數(shù)據(jù)指標(biāo)的相似度逐漸聚合在一起，從而使類間差異最大，而類內(nèi)差異最小[21]。用MetaboAnalyst 4.0 軟件對不同干燥方法的苦地丁中共有的37 個成分的相對峰面積進(jìn)行歸一化處理后得熱圖（Heatmap，圖2）。

由圖2 可以看出，不同干燥方法的苦地丁樣品分為2 類：1、3、4、6、9、10 號樣品聚為一類，說明這6 個樣品之間的相似性較高；其余樣品聚為一類。Heatmap 上的每個彩色單元格代表不同化學(xué)成分的相對含量，紅色越深，相對含量越高；顏色越深，含量越低。11 種不同干燥方法的苦地丁樣品的生物堿類成分含量均高于黃酮、氨基酸類。

圖2 不同干燥方式苦地丁藥材Heatmap

3.3 主成分分析

主成分分析是一種采用降維思想的多元統(tǒng)計(jì)方法，用于考察多個變量間的相關(guān)性。通過少數(shù)幾個主成分來揭示多個變量間的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，即從原始變量中導(dǎo)出少數(shù)幾個主成分，使其盡可能多地保留原始變量的信息，且彼此間互不相關(guān)。主成分分析法通過綜合多指標(biāo)評價不同干燥方法苦地丁藥材的品質(zhì)，克服了僅依靠單一變量評價藥材品質(zhì)的局限性，評價結(jié)果準(zhǔn)確可靠[21]。

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件將11 批樣品中37 個成分的相對含量結(jié)果組成矩陣，數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行主成分分析，主成分分析中特征值及方差貢獻(xiàn)率見表3。由表3 可知，前7 個主成分的特征值均大于1，表明前7 個主成分在苦地丁藥材質(zhì)量評價中起主導(dǎo)作用，7 個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)94.871%（＞85%），能較客觀地反映不同干燥方式苦地丁藥材的綜合質(zhì)量，故選取前7 個主成分進(jìn)行分析。

表3 苦地丁藥材中各成分旋轉(zhuǎn)后的主成分特征值及貢獻(xiàn)率

主成分是原始變量的兩兩不相關(guān)且具有最大方差的線性組合。原始變量對主成分的影響用載荷表示，載荷絕對值越大，影響越大[21]。從表3～4可以看出，第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為16.554%，小檗堿、L-谷氨酸的因子載荷值較大，說明第一主成分主要反映此類信息；第二主成分的方差貢獻(xiàn)率為16.288%，反映了oxocorynolineisomer、γ-glutamylvaline 的信息；第三主成分的方差貢獻(xiàn)率為15.703%，反映了波爾定堿、延胡索堿甲、spallidamine 的信息；第四主成分的方差貢獻(xiàn)率為15.664%，反映了罌粟堿、L-酪氨酸的信息；第五主成分的方差貢獻(xiàn)率為14.929%，反映了蘆丁、L-脯氨酸、天冬氨酸的信息；第六主成分的方差貢獻(xiàn)率為8.46%，反映了比枯枯靈、原阿片堿、紫堇靈的信息；第七主成分的方差貢獻(xiàn)率為7.273%，反映了noscapine、血根堿的信息。這7個主成分基本包含了大部分成分的信息。

表4 苦地丁藥材中各成分旋轉(zhuǎn)變換后的因子載荷矩陣

不同干燥方式的苦地丁樣品的主成分各因子總得分見表5，根據(jù)各主要因子的權(quán)重系數(shù)計(jì)算得出各樣品的綜合得分。權(quán)重系數(shù)依據(jù)主成分的方差貢獻(xiàn)率與8 個主成分的總方差貢獻(xiàn)率之比，主成分1 的權(quán)重為0.174 5，同理可得主成分2～8的權(quán)重分別為0.171 7、0.165 5、0.165 1、0.157 4、0.089 2、0.076 7。各主成分因子得分與其權(quán)重乘積之和相加得出各苦地丁樣品的總因子得分（F），其表達(dá)式為F=0.174 5F1+0.171 7F2+0.165 5F3+0.165 1F4+0.157 4F5+0.089 2F6+0.076 7F7，F(xiàn)值 越高，綜合質(zhì)量越好[21]。

表5 不同干燥方式苦地丁藥材的主成分因子及品質(zhì)綜合評價

3.4 苦地丁不同干燥方法的時間、能耗

苦地丁不同干燥方法耗能不同，由表6 可以看出，鼓風(fēng)干燥耗能＞真空干燥＞微波干燥，但由于曬干法與陰干法耗時久，受環(huán)境影響較大，如遇梅雨天氣，易出現(xiàn)霉變等現(xiàn)象。

表6 不同干燥方式苦地丁藥材的耗時耗能

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同干燥方法的苦地丁藥材質(zhì)脆，葉多皺縮，外觀差異不大，顏色有一定差異，如曬干的苦地丁藥材為黃綠色，陰干、真空干燥為暗綠色，微波干燥及鼓風(fēng)干燥均為淡黃綠色。前期已驗(yàn)證不同干燥方法的苦地丁藥材中紫堇靈的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥0.14%，符合《中華人民共和國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)，因此，本研究選取了曬干、陰干、微波干燥、鼓風(fēng)干燥、真空干燥5 種干燥方法，分別設(shè)置不同的溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用非靶向的HPLC-Triple-TOFMS/MS 代謝組學(xué)分析技術(shù)得到準(zhǔn)分子離子及碎片離子的元素組成等結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合文獻(xiàn)提供的數(shù)據(jù)鑒定化合物，同時QC 也為實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性提供了一定的依據(jù)。

苦地丁化學(xué)成分豐富，本研究通過HPLCTriple-TOF-MS/MS 技術(shù)對不同干燥方法的苦地丁藥材進(jìn)行鑒定，共鑒定出37 個差異化學(xué)成分，包括生物堿類、黃酮類、氨基酸類，其中生物堿類具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌等多種生物學(xué)特性[6]；黃酮類化合物是天然抗氧劑，具有抗氧化和清除自由基的作用；氨基酸類化合物是參與生命活動的小分子物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用[22]。文獻(xiàn)報(bào)道，不同干燥溫度對化學(xué)成分產(chǎn)生一定的影響，如鼓風(fēng)干燥法是目前中藥材常用的干燥方法，其溫度是影響藥材品質(zhì)的重要因素，溫度過高或時間過長會使藥物部分成分分解[22]。微波干燥法不適合氨基酸等熱敏類化學(xué)成分[4]。研究結(jié)果顯示，采用鼓風(fēng)干燥法與真空干燥法干燥的苦地丁藥材氨基酸類成分的相對含量均高于微波干燥法。真空干燥法是使藥材處于負(fù)壓狀態(tài)，可以避免化學(xué)成分發(fā)生氧化；傳統(tǒng)的曬干、陰干法受外界因素影響較大。37 個化學(xué)成分的主成分結(jié)果顯示，曬干、真空50 ℃、鼓風(fēng)50 ℃干燥的苦地丁藥材品質(zhì)優(yōu)于其他干燥方法。

干燥時間及能耗也是產(chǎn)地加工時需要考慮的因素，微波干燥速度較快，耗能較少；真空干燥耗時長，耗能多；傳統(tǒng)的曬干和陰干法對場地、環(huán)境的要求較高，干燥時間受環(huán)境因素影響大。綜上所述，在考慮苦地丁產(chǎn)地初加工時，可綜合考慮曬干法和鼓風(fēng)50 ℃干燥法。