苦參開花和授粉生物學特性的研究△

申國安，吳尚英，王玉龍，郭寶林*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2.山西振東道地藥材開發有限公司，山西 長治 047100；3.山西省長治市上黨區農業農村局，山西 長治 047100

苦參Sophora flavescensAit.為豆科槐屬植物，根部入藥，性苦，味寒，歸大腸、膀胱經，具有燥濕清熱、止癢殺蟲、利尿的功效，用于治療血痢、便血、黃疸、浮腫、小便不利、疥癩、濕瘡、瘙癢等[1]。苦參含有豐富的次生代謝產物，包括生物堿、黃酮類等。其中，苦參生物堿具有抗蟲、抗病毒、抗菌、抗肝損傷、抗腫瘤、抗胃黏膜損傷、抗心律失常、抗動脈粥樣硬化、抗炎、利膽、治療組織細胞增生和纖維化等作用[2-4]。苦參還被廣泛用于提取制造生物農藥[1,5]，市場需求量很大。但是因為其野生資源枯竭，現在主要通過人工栽培生產。

苦參是多年生豆科植物，可以通過地下莖無性繁殖，但繁殖系數較低。對于大規模栽培生產，種子繁殖是最好的方式。豆科植物授粉繁殖方式差異很大，其中部分具有典型的閉花授粉特性，在花朵尚未開放時已經基本完成了授粉，如大豆[6]；還有部分豆科植物自交不親和，必須異花授粉，如紫花苜蓿[7]。目前，苦參的開花習性和授粉行為等生殖性狀尚缺乏系統的研究。通過前期調查發現，苦參具有典型的閉花授粉特征，也存在異花授粉的特征。這些研究結果為苦參種質的保存、種子的生產和新品種培育提供了參考。

1 材料

1.1 樣品

研究所用苦參品種為“振苦1 號”，種植于山西沁縣西安莊苦參繁殖基地?；匚挥跁x東南地區，處于太行、太岳兩山之間，E112°41′，N36°45′，屬黃土丘陵山區，平均海拔1000 m，土壤主要為褐土。該地區屬溫帶半濕潤大陸性季風氣候，無霜期170 d，年平均日照時數2474 h，年平均氣溫8.9 ℃，年平均降雨量600 mm，相對濕度60%。實驗期間種植基地日間平均溫度和濕度分別為26 ℃和65%，夜晚平均溫度和濕度為17 ℃和76%。植株經中國醫學科學院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為苦參Sophora flavescensAit.。

1.2 儀器

HT-400B 型恒溫箱（上海赫田科學儀器有限公司）；CX43型生物顯微鏡［奧林巴斯（中國）有限公司］；PXS-A 型解剖鏡（上海普丹光學儀器有限公司）。

1.3 試藥

蔗糖（批號：DH326-1，北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；聯苯胺（批號：B804016-100mg，上海麥克林生化科技有限公司）；過氧化氫［批號：H1009，西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司］。

2 方法

2.1 花粉萌發力實驗

分別配制5%、10%、15%的蔗糖溶液。選取剛剛開放的苦參花朵用于觀察。在載玻片上加1 滴培養液，在培養液上方輕輕振動花藥，使花粉散布于培養液上。將載玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養皿中，置于25 ℃黑暗恒溫箱中5 h。顯微鏡觀察花粉萌發情況，每個樣品隨機選取3 個視野統計萌發率。以花粉管長度超過花粉直徑2倍為正常萌發[8]。

2.2 柱頭可授性實驗

用聯苯胺-過氧化氫法對柱頭可授性進行測定[9]。聯苯胺-過氧化氫反應液按照1%聯苯胺-3%過氧化氫-水（4∶11∶22）進行配制，現配現用。去掉外面的部分花瓣，露出柱頭。將柱頭浸入聯苯胺-過氧化氫溶液，放置1 min，在解剖鏡下進行觀察。如果柱頭具有可授性，將在柱頭周圍出現大量的氣泡，附近的溶液變為藍色。

3 結果

3.1 苦參小花發育階段的劃分

苦參是多年生草本植物，地上部莖葉在冬季枯死。第二年春天從地下莖萌發出新芽，長出新的枝條。每個枝條在接近頂部會產生2～4 個小分枝，花序著生在每個分枝頂端。主花序首先開放，花期6—8 月。苦參為總狀花序，通常29～35朵小花?；ㄐ蚧康男』ㄗ钤绨l育，小花自下而上依次開放。每朵小花開放2～3 d。苦參為典型的蝶狀花，包括旗瓣、龍骨瓣、翼瓣、10 枚雄穗和花柱。隨著苦參小花發育成熟，花朵逐漸變大，同時雄蕊和雌蕊呈現非常顯著的形態和生理變化（圖1）?；ㄖ诎l育成熟的時候，柱頭出現黏液，有助于黏附花粉粒，促進花粉的萌發。雄蕊在發育成熟的時候，花藥發生破裂，釋放花粉。根據苦參花器官的外觀大小和雌雄蕊的發育程度，本研究把苦參小花的發育過程大致分為7 個階段（表1）。S1 階段小花體積較小，花瓣長5 mm左右，花瓣呈現淺綠色，完全被綠色的萼片包裹，柱頭沒有黏液；S2 階段小花體積有明顯增大，花瓣微微露白，長約6.8 mm，柱頭已經迅速發育，柱頭開始出現黏液，但是檢測不到花粉；S3階段小花仍然閉合，體積繼續明顯增加，柱頭上檢測不到花粉，S2階段和S3階段柱頭都有黏液，但是還沒有花粉出現在柱頭上；S4 階段小花仍然閉合，體積增大明顯，柱頭上開始能檢測到花粉，說明已經有花藥成熟，開始釋放；S5 階段小花繼續發育長大，旗瓣沒有打開，柱頭上有花粉，說明花瓣在沒有打開之前，花藥已經成熟并部分釋放；S6 階段，旗瓣張開明顯，從外部可以看到花藥，花藥已經破裂，花粉大量釋放。此時，花瓣剛剛張開不久，花粉活力最高；S7 階段，旗瓣展開，花瓣和花萼之間形成明顯空隙，花藥完全枯萎，但是柱頭繼續伸長。

表1 苦參小花不同發育階段的形態和生理特征（,n=10）

表1 苦參小花不同發育階段的形態和生理特征（,n=10）

圖1 苦參小花發育不同階段的典型特征

對花器官發育的觀察結果表明，小花在開放之前，花粉已經成熟，開始釋放。在小花完全開放之后，花粉迅速失活，但是柱頭繼續伸長，意味著苦參存在異花授粉的可能。異花授粉能夠增加群體的遺傳多樣性，增強對環境的適應性。

3.2 苦參小花不同發育階段花粉活力與柱頭可授性

在對苦參小花的形態特征進行研究后，把苦參花器官的發育分為7 個階段。進一步，對每個發育階段的花粉和柱頭活力進行了分析（表2、圖2）。花粉在S3 階段開始具有活力，但是沒有在柱頭上觀察到花粉，說明此時花粉只是部分發育成熟，花藥還沒有開裂，但是在花粉釋放之前，已經部分具有活力。在S4、S5 階段，花粉活力急劇增加，在柱頭上也觀察到了花粉粒，說明花藥開始部分釋放。在S6階段，花粉活力達到最高，此時花朵已經開放。

圖2 不同發育階段花粉活力和柱頭活性變化規律（,n=3）

表2 不同發育階段花粉活力和柱頭可授性分析（,n=3）

表2 不同發育階段花粉活力和柱頭可授性分析（,n=3）

注：+表示柱頭具有可授性；-表示柱頭沒有可授性。

以上結果表明，花粉和柱頭的生理活性跟花器官的外部形態特征具有相關性，將苦參花器官的發育劃分為7 個階段是合適的。當花瓣長11.5～11.8 mm，花粉活力最強，此時是授粉的最佳時期。在S7階段，小花旗瓣松動，可以看到花藥呈現褐色，花粉活力急劇下降。柱頭的發育速度比花藥要慢，有滯后現象。在S5 階段，當花瓣長度＞11.5 mm，花瓣仍然處于閉合狀態，但柱頭已具有可授性。此時，花粉活性已經較高，可觀察到花粉釋放，柱頭上粘有花粉。但在S7 階段，花粉活力幾乎完全喪失，柱頭仍然有活性，意味著柱頭有能力接收外源的花粉。

3.3 開花后苦參花粉活性的變化

植物開花以后，花粉的活力會迅速降低，失活的速度因植物而異。花粉存活的時間越長，其能被風和昆蟲攜帶的越遠，越可能實現異花授粉。分別使用5%、10%、15%的蔗糖溶液進行測試，結果顯示，使用10%蔗糖溶液，苦參花粉萌發效果最佳，適合用于花粉萌發實驗，這與多數植物中的實驗結果一致[10]。因此，選用10%的蔗糖溶液對花粉在各種條件下的活力進行了測試，結果如表3 所示，在室溫（約25 ℃）下，苦參花粉活力在開花后12 h仍然保持在80%以上；12 h 后，花粉活力下降明顯。超過72 h，活力為原來的30%左右，此后花粉活力急劇降低，幾乎全部喪失。結果說明，開花當天苦參花粉的活性最好，但是在72 h 之內仍然能保持一定活力，意味著苦參花粉有機會被傳播得很遠。如果進行人工授粉，最好在12 h之內使用花粉。

表3 苦參開花后不同時間不同溫度下的花粉活力（,n=3） %

表3 苦參開花后不同時間不同溫度下的花粉活力（,n=3） %

注：*P＜0.05。

花粉的存活時間跟溫度有一定的關系，在低溫情況下，活力保持時間更長[11-12]。在4 ℃下，苦參花粉失活速度顯著降低，在96 h后，仍有28.89%花粉具有萌發能力。因此，在育種實踐中，可以把花粉放在4 ℃保存，適當延長花粉的活性，解決花期不遇的問題。

3.4 苦參柱頭可授性的日間變化

植物柱頭活力在1 d中會有一定的變化，多數植物的柱頭活力在上午較高。檢測1 d中柱頭活力最高的時間段，可以幫助確定最佳的人工授粉時間，對雜交育種具有重要的指導意義。選用苦參處于S6 階段的小花，用于觀察柱頭可授性在1 d的變化，結果發現，在7：00—9：00，柱頭可授性最強，9：00之后，柱頭可授性下降，13：00 之后，柱頭失去可授性，但在19：00 柱頭的可授性得到一定恢復。這些結果說明，苦參柱頭上午活力強，因此人工雜交授粉最好在9：00 之前進行。苦參柱頭活性在傍晚有所恢復，可能是受到內在的生物節律調控，也可能是因為柱頭可授性受到外部環境因素影響，與溫度、濕度有一定關系。中午溫度高、濕度低，導致柱頭活性降低，這一點需要未來繼續深入研究。

4 討論

研究植物的生殖特性，特別是花發育的過程，對育種實踐和理論研究具有重要的指導意義。豆科植物的花發育具有獨特性[13-15]，但是苦參的花發育研究較少。本研究把苦參的小花發育分為7 個時期，不僅參考了小花發育的外觀特征變化，還考慮了花粉的活性和柱頭的授粉能力，能夠反映花器官形態和生理特征的重要轉變階段，為深入研究苦參的傳粉和生殖發育提供了參考。這種劃分與其他豆科植物上的研究結果類似，如根據大豆花朵由幼蕾至花冠開放的特征將其劃分為9個時期[16]。

花的發育主要涉及雌雄生殖器官的發育。苦參雄蕊的發育很快，在花朵完全開放之前，已經發育成熟，花粉具有授粉的活力。雖然雌蕊發育滯后于雄蕊的發育，但是在花朵沒有開放之前，花柱已經成熟并出現黏液，具有了可授性。尤其是在花朵開放之前，花粉已經破裂釋放，柱頭上可以觀察到黏附有花粉粒，說明苦參呈現出典型的閉花授粉行為。因為在開花之前授粉已經進行，所以在做雜交育種的時候，去雄操作應該在小花發育的S3、S4 階段之間進行。如果去雄太晚，雄蕊破裂，花粉大量釋放，可能已經完成授粉。柱頭的活力在上午9:00 之前最強，所以去雄和授粉以上午為最好。柱頭的活力可以持續很長時間，所以人工授粉可以在去雄之后連續3 d 多次進行，增加授粉成功幾率。