基于“藥輔合一”制備艾天羊肌肉關節通絡膏Ⅱ并評價藥效

許蕊蕊，陳金素，李越，邱仁杰，王秀麗*，鄒博林，陳培

1.北京中醫藥大學，北京 102488；2.云南省中醫醫院，云南 昆明 650021；3.艾天羊生物科技有限公司，四川 綿陽 622659

中藥復方制劑因為成分極其復雜，往往需要添加大量的輔料以促進成型。輔料在制劑中發揮重要作用，如成型、促進主藥發揮藥效等。然而，高比例輔料不僅增加患者服藥量及心理和經濟負擔，降低患者順應性，也增加了不良反應的可能性，消耗更多的資源。如果制劑中能應用既發揮藥效、與主藥協同作用，又能發揮輔料的促進成型等功能的材料，則一舉兩得。“藥輔合一”的理念便源于此。

艾天羊肌肉關節通絡方系由乳香、沒藥等10 余種中藥組成的經驗方，具有活血化瘀、消炎止痛等功效。鑒于其原本應用形式為藥物細粉與凡士林混合，制得按摩膏，不利于藥物成分溶出、患者順應性差等問題，本課題組通過95%乙醇提取原料藥后，將提取濃縮液制備得到以中鏈脂肪酸為油相的普通乳膏——艾天羊肌肉通絡膏（ATY乳膏），實現了改善有效成分溶出和提高患者順應性的目標。本研究在ATY 乳膏基礎上，運用“藥輔合一”的理念，將ATY 乳膏油相的中鏈脂肪酸用薄荷油替代，得到ATY 乳膏Ⅱ，其中薄荷油既發揮承載藥物、構成乳膏、促進主藥透皮的輔料作用，又可以很好地發揮止痛、疏散風熱等治療作用，有助于促進艾天羊肌肉關節通絡方的抗炎、鎮痛作用。

1 材料

1.1 試藥

乳香、沒藥等中藥飲片購于廣州市嶺南中藥飲片有限公司佛山分公司，符合《中華人民共和國藥典》2015年版相關項下的要求。

硬脂酸（批號：CG10070082，上海麥克林生化科技有限公司）；單硬脂酸甘油酯（批號：C10286479，北京華威銳科化工有限公司）；薄荷油（安徽酷爾生物工程有限公司）；十二烷基硫酸鈉（批號：1202021，廣東省精細化學品工程技術研究開發中心）；尼泊金乙酯、冰醋酸（天津市福晨化學試劑廠）；二甲苯、丙三醇（批號分別為20160805、20161005，北京化學試劑公司）；消傷痛搽劑（安陽中智藥業有限責任公司）；無水乙醇（分析純，北京化工廠）；去離子水（實驗室自制）。

1.2 儀器

DFT-100A 型手提式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；CP225D 型十萬分之一電子分析天平（Sartorius 公司）；KQ-300DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DB-3 型熱板儀（常州普天儀器制造有限公司）；101-1AB 電熱風干燥箱（天津賽得利斯實驗儀器制造廠）。

1.3 動物

SPF級KM 小鼠，體質量18～22 g；SD 大鼠，體質量180～220 g，合格證號：SCXK（京）2016-0002，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司，飼養于北京中醫藥大學動物房。

2 方法與結果

2.1 藥液的提取

稱取處方量乳香、沒藥等中藥飲片，打成細粉過80 目篩，置2000 mL 具塞錐形瓶中，搖勻。加入95%乙醇1000 mL 振蕩，使得乙醇浸潤所有粉末，避光保存。72 h 后，減壓抽濾，避光保存濾液，濾渣繼續用1000 mL 95%乙醇避光浸提；24 h 后，減壓抽濾，避光保存濾液，濾渣繼續用1000 mL 95%乙醇避光浸提；24 h 后，減壓抽濾，合并3 次的濾液，回收乙醇至藥液質量濃度約為0.82 g·mL-1，即得提取液。

2.2 Box-Behnken響應面法優選乳膏基質處方

2.2.1 實驗設計 預試驗發現，油/水相質量比、促透劑的添加劑量及藥液的用量，均對ATY 乳膏Ⅱ的質量產生影響。因此，在預實驗基礎上，以油/水相質量比（A）、促透劑的添加劑量（B）和藥液與基質質量比（C）設為自變量，以綜合評分（Y）為評價指標，每個因素選取低、中、高3 個水平，因素水平見表1。

表1 ATY乳膏Ⅱ基質處方設計因素與水平

2.2.2 考察指標及評價方法 在篩選處方過程中，以外觀均一性、涂抹延展性、離心穩定性、耐寒性和耐熱性作為乳膏質量評價的指標，各項考察指標的評價方法[1-2]：1）外觀均一性。取適量樣品，觀察外觀質地是否均勻、顏色是否一致、靜置是否會自然分層。2）涂布延展性。取適量樣品，在表面皿上涂布，觀察涂布過程中有無結塊、是否會產生顆粒。3）離心穩定性評價。取適量乳膏于2 mL 的EP 管中，4000 r·min-1離心15 min（離心半徑為5 cm），觀察是否發生分層、變色等油水分離現象。4）耐寒性。取適量乳膏于2 mL 的離心管中置-20℃放置24 h，取出放至室溫，觀察實驗樣品是否發生分層、變色等油水分離現象。5）耐熱性。取適量乳膏于2 mL 的EP 管中，密封，于50 ℃恒溫箱中，恒溫保持6 h，觀察上述實驗樣品是否發生分層、變色等油水分離現象（表2），評分情況見表3。

表2 ATY乳膏Ⅱ處方篩選各項考察指標評分

表3 ATY乳膏Ⅱ處方綜合評分

2.2.3 模型擬合 采用Design-Expert 對上面數據進行分析，以Y對自變量進行模型擬合，并通過r等對擬合模型進行評價，通過比較各擬合方程的擬合度，得到二次多項式回歸方程Y=93.28-1.13A-5.81B+0.63C+0.37AB+2.25AC-0.37BC-8.37A2-10.97B2-5.87C2，r=0.993 1，P＜0.000 1，F=111.57，表明模型差異有統計學意義；失擬項P=0.309 9＞0.05，失擬項差異無統計學意義，說明該模型擬合度和可信度均有效，實驗誤差小，可以用此模型對薄荷油處方進行分析和預測，結果見表4。

表4 ATY乳膏Ⅱ二次多項式方程模型方差分析

2.2.4 響應面優化分析 根據擬合方程，通過Design-Expert V8.0.6.1 軟件繪制評價指標隨因素變化的等高線圖和響應面圖，見圖1～3。

圖1 油/水相質量比與藥液與基質質量比等高線圖與響應面圖

圖2 油/水相質量比與促透劑的添加劑量等高線圖與響應面圖

圖3 促透劑的添加劑量與藥液與基質質量比等高線圖與響應面圖

由圖1～3 可知，油/水相質量比、促透劑添加劑量和藥液的用量對綜合評分影響均成拋物線形，即隨著因素的增大，綜合評分呈先增大后降低的趨勢，因此，在提取工藝中適當提高三者比例可以提高綜合評分。由表4 可知，促透劑添加劑量對綜合評分的影響不如其他2 個因素顯著，隨著其添加比例的提高綜合評分先升高，繼而緩慢降低，因此，在實際應用中應控制促透劑的添加劑量在最佳范圍。

根據回歸模型分析且考慮實際操作的可行性，各因素值保留為整數，ATY 乳膏Ⅱ最優處方：油/水相質量比為35∶65、促透劑的添加劑量為8%、藥液與基質質量比為1∶10。

2.3 乳膏的制備

2.3.1 ATY 乳膏的制備 稱取處方量硬脂酸、單硬脂酸甘油酯和尼泊金乙酯，于1000 mL 蒸發皿中80 ℃水浴加熱熔融后，加入中鏈脂肪酸135 g（邊加入邊攪拌）攪勻后，加入提取液90 mL（邊加入邊攪拌），1 h 后，加入剩余脂溶性原料，攪拌均勻后加入促透劑，攪勻既得油相。稱取處方量十二烷基硫酸鈉加入純凈水中，80 ℃水浴加熱融化十二烷基硫酸鈉，再加入處方量的甘油，既得水相。制備好的油相加入水相中，邊加邊攪拌，攪拌均勻，保鮮膜密封避光放涼即得。

2.3.2 ATY 乳膏Ⅱ的制備 除把中鏈脂肪酸替換為薄荷油外，其余操作同2.3.1項下的制備方法。

2.4 藥效學實驗

2.4.1 ATY乳膏及ATY乳膏Ⅱ對小鼠痛閾值的影響

2.4.1.1 方法 將小鼠置于熱板儀［溫度為（55±0.5）℃］上，從小鼠足底接觸熱板至出現舔后足的時間為該小鼠的痛閾值，5 s＜痛閾值＜30 s 的小鼠為合格。選擇痛閾值合格小鼠30 只，隨機分為空白組、ATY 乳膏組、ATY 乳膏Ⅱ組，每組10 只小鼠。各組小鼠兩后足涂抹給藥，空白組給予0.9%氯化鈉溶液0.2 mL/只，ATY 乳膏組和ATY 乳膏Ⅱ組給藥劑量均為0.4 g/只。每日涂抹3次，每次涂抹后按摩20 min，連續給藥10 d。各組動物在末次給藥后30、60、90、120 min分別測定各小鼠痛閾值（痛閾值超過60 s，即停止測試，按60 s 記），各組間痛閾值的比較可以通過柱狀圖更直觀地看出，具體結果見圖4。

圖4 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ對小鼠痛閾值的影響（,n=10）

2.4.1.2 結果 與空白組比較，ATY 乳膏和ATY乳膏Ⅱ均可顯著提高小鼠痛閾值（P＜0.01），且改進后的ATY 乳膏Ⅱ比ATY 乳膏效果更好，結果見表5。

表5 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ對小鼠痛閾值的影響（,n=10）

表5 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ對小鼠痛閾值的影響（,n=10）

注：與空白組相比，*P＜0.01；表6同。

2.4.2 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ對小鼠的鎮痛作用

2.4.2.1 造模、分組與給藥 分組與給藥同

2.4.1.1 ，連續給藥10 d。末次給藥6 h 后，每只小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸0.2 mL，記錄注射后15 min內因疼痛發生扭體的次數及開始出現扭體反應的時間（即扭體反應潛伏期）。

2.4.2.2 結果 與空白組相比較，ATY 乳膏組和ATY 乳膏Ⅱ組小鼠扭體反應次數明顯減少（P＜0.01），扭體反應潛伏期明顯增長（P＜0.01），且改進后的ATY 乳膏Ⅱ比ATY 乳膏鎮痛效果更好。將各組小鼠鎮痛作用繪制成柱狀圖，可以直觀地看出，模型組與空白組和給藥組之間差異有統計學意義，說明藥效較好，結果見圖5。

圖5 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ對小鼠鎮痛作用的影響（,n=10）

2.4.3 ATY 乳膏和ATY 乳膏Ⅱ對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

2.4.3.1 方法 將小鼠隨機分為3 組，分別為模型對照組、ATY乳膏組和ATY乳膏Ⅱ組。在小鼠左耳前后均勻給藥，空白組給予0.9%氯化鈉溶液0.2 mL/只，ATY 乳膏組和ATY 乳膏Ⅱ組給藥劑量為0.4 g/只。給藥6 h后，小鼠左耳里、外兩面涂抹二甲苯0.05 mL，右耳不涂為正常對照。15 min 后處死小鼠，剪下雙耳，用9 mm 內徑打孔器在雙耳的同一部位打孔并稱質量。計算小鼠耳腫脹度。

2.4.3.2 結果 與空白組相比較，模型對照組小鼠耳腫脹程度顯著增高（P＜0.01），說明造模成功；與模型對照組相比較，ATY 乳膏組和ATY 乳膏Ⅱ組可顯著降低二甲苯致小鼠耳腫脹的程度（P＜0.01）。結果見表6。

表6 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（,n=10）

表6 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（,n=10）

注：與空白組相比，▽P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.01。

3 討論

艾天羊肌肉關節通絡方以乳香、沒藥為君藥。乳香、沒藥配伍應用始見于“乳香止痛散”（《證治準繩》）[3-4]。其中，乳香味辛，性溫，芳香，具有調氣活血，治療癰瘡腫毒、跌打損傷的作用；沒藥性平，具有治療跌打損傷、金瘡、筋骨、癰疽腫痛等作用。現代醫學也已表明，乳香具有抗炎抗菌、抗氧化等藥理作用[5-6]。沒藥具有抗炎、凝血、鎮痛等藥理作用[7-8]。乳香沒藥同用，可以同時活血祛瘀、消炎鎮痛，協同增效。自古以來，臨床應用中運用乳香活血、沒藥散血的功效，且兩者皆能止痛消腫，因此，兩者常以藥對形式相兼而用。現代實驗研究也表明，乳香、沒藥配伍后產生的藥效在藥理作用的層面上也體現為協同增效[9-11]。除此之外，本方中添加的薄荷性涼，芳香升散，有解熱、抗炎、鎮痛等作用。已有研究表明，薄荷油可刺激中樞神經，使皮膚毛細血管擴張，促進汗腺分泌，增加散熱，有發汗解熱作用[12]。因此，薄荷油的添加對于該方的臨床應用和患者的使用感受均有不可替代的作用。

“藥輔合一”，是指制劑處方中部分中藥兼任原料和輔料的雙重角色。2010 年，國家就已經把藥用輔料的開發列入了重點研究課題[13]；2016 年，《國家重點支持的高新技術領域》中也將制劑新輔料開發納入其中，因此，藥用輔料已經成為了研究熱點。本研究所研制的外用制劑，增加藥物的滲透性是關鍵。因此，結合“藥輔合一”的理念，考慮到中藥的某些揮發油或芳香成分能促進藥物的吸收與跨膜轉運，并且其本身的藥理活性可以治療疾病的雙重特點，可以考慮將其作為透皮促進劑[14]。所以本方中的薄荷油既作為乳膏中的油相，起到承載脂溶性提取物及構建乳膏的作用，還能夠發揮促進藥物透皮吸收、止痛、疏風散寒等作用，既充當著輔藥，保證臨床藥效，又可以作為輔料制成制劑成型，有效地減少了合成促透劑的使用量，一定程度上減輕了不良反應，提高了制劑的安全性。

4 結語

綜上所述，本研究對于薄荷油的利用是對“藥輔合一”思想的合理詮釋，也為今后薄荷油的綜合開發提供了理論基礎，因此，未來應該給予“藥輔合一”研究更多重視，這不僅有利于提高中藥制劑的藥效，還能推動中藥現代化的發展，使中醫藥文化一直維持生命活力，也使中華瑰寶在世界大放異彩。