銅綠微囊藻溶藻菌EA-1的分離鑒定及溶藻特性

盧 露,馬金玲,牛曉君,*,張冬青,鄭小賢,林 璋

銅綠微囊藻溶藻菌EA-1的分離鑒定及溶藻特性

盧 露1,馬金玲1,牛曉君1,2*,張冬青2,鄭小賢1,林 璋1

(1.華南理工大學環境與能源學院,廣東 廣州 510006；2.廣東石油化工大學環境科學與工程學院,廣東省石油化工污染過程與控制重點實驗室,廣東 茂名 525000)

從廣州流花湖分離獲得一株溶藻菌株EA-1,16S rDNA分析表明菌株EA-1 屬于腸桿菌屬 ().研究了腸桿菌EA-1對銅綠微囊藻的溶藻效果和溶藻機制.結果表明,對數期EA-1具有最佳溶藻效果,投加比例為10%,初始葉綠素a 含量為1.43mg/L時,EA-1能實現3d內完全除藻,葉綠素a 含量為2.39mg/L時,共培養6d后,抑制率為84.1%±1.3%.EA-1通過分泌胞外溶藻物質間接溶藻,生理生化響應表明,EA-1無菌濾液脅迫下,藻細胞膜脂過氧化損傷嚴重,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性先急劇上升后下降.三維熒光光譜(EEM)表明溶藻產物為類腐殖酸,類富里酸和類蛋白類物質.掃描電子顯微鏡(SEM)顯示藻細胞出現褶皺,內陷和萎縮現象.透射電子顯微鏡(TEM)顯示藻細胞破壞過程為:首先,膠質層與細胞壁分離,光合片層變得松散和不規則,內含物被部分降解.隨后,光合片層被徹底破壞,DNA核物質和多聚磷酸鹽等營養物質顆粒被降解,藻細胞內部結構被完全破壞,藻細胞死亡.

腸桿菌；銅綠微囊藻；溶藻特性；生理響應；細胞形態；細胞超微結構

近年來,人為富營養化加劇和全球氣候變暖導致有害藍藻水華在世界各地頻繁爆發,如何解決藍藻水華已成為全球性環境問題之一[1].許多措施,包括化學、物理和生物法,已被應用于藍藻水華防治.常用物理法包括:機械打撈、超聲、紫外線照射、等離子體放電、黏土礦物吸附等.常用化學方法包括:氯化法(如:次氯酸鈉、氯氣)、金屬法(如:硫酸銅、高錳酸鉀、高鐵酸鉀)、氧化劑(如:臭氧、過氧化氫)、除草劑(如:杜倫)、天然化合物衍生化學品(如:乙基2 -乙酰乙酸甲酯)和其他化學物質等[2].物理和化學法對有害藻類具有很強的殺滅作用,然而,因為高成本、難以大規模應用、二次污染引入、非目標生物毒性等缺陷,這些方法的應用受到了限制.尤其值得關注的是,化學氧化過程會造成藻細胞損傷裂解,導致細胞代謝產物藻毒素等大量釋放出來,使水體毒性增加[3].微生物制劑由于其巨大的溶藻潛力和生態友好性,已成為近年來水體富營養化治理最具前景的手段[4].過去的幾十年,眾多溶藻細菌被從水華末期水體、活性污泥、土壤、植物等介質中分離和鑒定,并表現出高效溶藻活性.溶藻細菌中革蘭氏陰性菌比例高達95%,由細胞吞噬菌/黃桿菌/擬桿菌(CFB)和g-變形桿菌構成,分別占比50%和45%.CFB集團主要包括:噬細胞菌屬()、黃桿菌屬()和芽胞桿菌屬(),g-變形桿菌主要包括:假單胞菌屬()、交替假單胞菌屬()和假交替單胞菌屬().其余5%則由厚壁菌門()和放線菌()的革蘭氏陽性菌構成[5].然而,關于腸桿菌溶藻能力和溶藻機制的研究報道還很匱乏[6].

銅綠微囊藻是最常見也最具破壞力的優勢水華藻種,其產生的微囊藻毒素具備強烈的肝毒性,對環境和人類健康構成嚴重威脅[7].目前,實驗室規模研究多采用初始藻密度介于104～106cells/mL的藻液,對初始藻密度更高的藻的溶藻效果研究比較少.此外,絕大多數已報道的溶藻細菌需要5～12d的溶藻時間以達到90%的去除率,例如,銅綠微囊藻初始葉綠素a含量為0.4, 0.5, 0.7mg/L時,KY-34[8],HG-16[9]andAF-1[10]分別需要8d,7d和6d以達到90%的溶藻率.過長的溶藻時間加劇了溶藻菌對實際藻華水體中藻的根除難度[11].因此,探索更高效的溶藻劑以及減短溶藻時間至關重要.

本研究的主要目的是探索菌株EA-1對銅綠微囊藻的溶藻效果和潛在機制.

1 材料與方法

1.1 藻種來源與培養方法

銅綠微囊藻(FACHB-905)購買于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫.藻種采用 BG11 培養基于恒溫光照培養箱中培養,培養條件設置為:溫度(25 ± 1)°C,光照強度 2000lx,光暗周期12h:12h[10].

1.2 溶藻菌株來源、鑒定與培養

選取中國廣州流花湖公園富營養化湖(23°8'14“N,113°14'47”E)為采樣點,采集湖泊表層水樣和湖泊附近區域土壤樣品,于實驗室中進行菌株分離工作,經篩選純化,從土壤樣品中分離得到溶藻菌株EA-1.

使用DNA提取試劑盒(Sangon Biotech Co., Ltd.)提取菌株培養物DNA,使用通用引物:27F(5'- AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGT- TACCTTGTTACGACTT -3')在DNA熱循環儀(Eppendorf, Germany)中擴增細菌16s rDNA.使用Takara DNA純化試劑盒(TaKaRa, Dalian, China) 對PCR產物進行純化,通過DNA測序儀(Applied Biosystems, US)進行測序.將16S rRNA序列與從NCBI-BLAST數據庫獲得的核苷酸序列進行同源性比較.利用MEGA7.0軟件,采用鄰接(Neighbor- Joining)分析法構建系統發育樹[12].

菌株活化和發酵均采用改良察式培養基(M-CDB),成分(g/L):10蔗糖,1KNO3,0.5K2HPO4, 0.5MgSO4?7H2O,0.5NaCl,0.02FeSO4[13].將種子培養物以2%劑量接種到M-CDB培養基中,于30℃、180r/min條件下振蕩培養制備發酵液.

1.3 菌株EA-1溶藻特性研究

1.3.1 EA-1不同生長階段對溶藻活性影響 將10mL對數期(培養10h),穩定期(培養24h),衰亡期(培養34h)的EA-1菌液添加到90mL對數期銅綠微囊藻培養物中,藻液初始葉綠素a含量為1.73mg/L.對照組不加菌液而加等體積M-CDB培養基.

1.3.2 EA-1菌液不同投加量對溶藻活性影響 將對數期EA-1菌液,以5%,10%和15%()比例,添加至85mL對數期銅綠微囊藻培養物中,藻初始葉綠素a含量為1.63mg/L,不足部分用M-CDB培養基補足,總體積固定為100mL.對照組不加菌液而加等體積M-CDB培養基.

1.3.3 初始葉綠素a含量對溶藻活性影響 將10mL對數期EA-1菌液,以10%()比例,投加至90mL初始葉綠素a含量分別為0.69mg/L(細胞密度=5.5′106cells/mL),1.43mg/L(細胞密度=1.1′107cells/mL), 2.39mg/L(細胞密度=1.9′107cells/mL)的銅綠微囊藻培養物中.對照組不加菌液而加等體積M-CDB培養基.

1.4 溶藻模式探究

首先,將10mL EA-1菌液于4℃、6000r/min條件下離心以獲得細菌菌體和上清液,隨后,將收集的菌體沉淀用PBS緩沖溶液(0.1mol/L, pH=7.4)洗滌3次,并用10mL去離子水重懸.上清液通過0.22μm孔徑的PES膜濾(直徑45mm;Millipore,USA)以獲得無菌濾液.將10mL菌液、去離子水細胞重懸液、無菌濾液,以10%()比例投加至90mL對數期銅綠微囊藻培養物中,藻初始葉綠素a含量為1.48mg/L.對照組不加菌液而加等體積M-CDB培養基.

1.5 分析方法

1.5.1 藻細胞計數、葉綠素a測定與抑制率 將濃藻液進行梯度稀釋,得到OD680=0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0和1.2的藻液并通過200目篩網,隨后,將樣品稀釋100倍后通過流式細胞儀計數.葉綠素a測定采用90%丙酮萃取法[14].

Chl-a含量計算公式如下:

式中: Chl-a單位為mg/L; OD為不同波長下吸光度;為樣品量;1為上清液定容體積;為比色皿光程(cm)

抑制率計算公式如下:

式中:e為抑制率;c為對照組Chl-a含量;t為實驗組Chl-a含量

1.5.2 丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶活性測定 將對數期EA-1無菌濾液,以5%,10%和15% ()比例,添加至85mL對數期銅綠微囊藻培養物中,對照組不加菌液而加等體積M-CDB培養基.每隔24h取樣20mL,連續取樣6d.粗酶液制備:將20mL樣品離心收集藻細胞,浸入2mL預冷的PBS緩沖液(0.1mol/L, pH 7.4)中,冰水浴條件下超聲破碎10min(100W;超聲時間為5s;間隔時間為5s),離心所得上清液即粗酶液儲存在-20°C,進行酶活性測定[15].丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性采用相應試劑盒測定(南京建城生物工程研究所,中國).

1.5.3 胞外溶解性有機物(EDOM)組成測定 將對數期EA-1無菌濾液,以5%,10%和15% ()比例,添加至85mL對數期銅綠微囊藻培養物中,對照組不加菌液而加等體積M-CDB培養基.共培養2d,4d,6d后,混勻,離心,取上清液過0.45 μm濾膜得到胞外溶解性有機物溶液,使用熒光分光光度計(F-7000, Hitachi, Japan)進行檢測.激發波長()掃描范圍為220～480nm,發射波長(m)掃描范圍為230～600nm,步長為5nm,掃描速度為12000nm/min[16].

1.5.4 藻細胞表面形態觀察 將對數期EA-1無菌濾液,以10%()比例,添加至90mL對數期銅綠微囊藻培養物中,對照組不加菌液而加等體積M-CDB培養基.共培養3d后,用掃描電鏡(SEM)對銅綠微囊藻細胞進行觀察.樣品處理過程如下:4℃、6000r/min條件下離心10min收集藻細胞,4℃下用2.5%()戊二醛溶液固定24h, PBS緩沖液(0.1mol/L, pH = 7.4)洗滌藻細胞3次.隨后,將樣品通過一系列35%～100%的乙醇溶液進行梯度脫水處理,每種濃度處理15min,乙酸異戊酯用于浸入藻細胞至少30min[17].冷凍干燥后在真空條件下噴金以增強電導率,用場發射掃描電鏡(Carl Zeiss Microscopy, Germany)觀察.

1.6 數據分析

所有實驗組和對照組均設置3組平行,實驗結果以均值±標準偏差表示.SPSS軟件(版本25.0)用于分析數據,采用單因素方差分析和鄧肯多范圍檢驗(DMRT)法對不同處理組之間的顯著性差異進行分析,顯著性水平設置為<0.05.不同大寫字母(A、B、C、D)表示各組組間存在顯著性差異,不同小寫字母(a、b、c、d、e、f)表示各組在不同處理時間下存在顯著性差異.使用Origin 9.1軟件繪圖,圖中誤差棒代表三次實驗之間的標準偏差.

2 結果與討論

2.1 溶藻菌株鑒定

圖1為菌株EA-1掃描電鏡,菌體呈短桿狀,單個細胞大小約為0.2～0.3μm寬,0.5～2μm長.圖2為菌株EA-1系統發育樹, EA-1的16S rDNA序列與strain 070(GenBank:CP050073.1)相似度最高,達到95%,因此,初步鑒定菌株EA-1屬于腸桿菌屬(sp.),將其命名為sp. EA-1,該菌株16S rDNA序列已提交至GenBank數據庫,登錄號為JX983654.

圖1 溶藻菌EA-1掃描電鏡

圖2 溶藻菌EA-1系統發育樹

2.2 共培養實驗

圖3 不同生長階段EA-1菌液對溶藻活性影響

不同大寫字母表示各組組間葉綠素a含量存在顯著性差異,不同小寫字母表示各組在不同處理時間下葉綠素a含量存在顯著差異,相同字母表示無顯著差異

圖4 EA-1菌液不同投加量對溶藻活性影響

不同大寫字母表示各組組間葉綠素a含量存在顯著性差異,不同小寫字母表示各組在不同處理時間下葉綠素a含量存在顯著性差異,相同字母表示無顯著差異

2.2.1 EA-1不同生長階段對溶藻活性影響 不同生長階段EA-1菌液對銅綠微囊藻溶藻活性如圖3所示.隨著培養時間延長,對照組中葉綠素a含量上升至3.69mg/L(=6d).對數期、穩定期和衰亡期EA-1菌液處理組均對銅綠微囊藻表現出顯著抑制效果,共培養6d后,不同處理組之間葉綠素a含量表現出顯著性差異,其中,對數期EA-1菌液表現出最高溶藻活性,共培養4d后,葉綠素a含量降低至0.18mg/L,抑制率為93.7%.穩定期和衰亡期EA-1菌液在共培養6d后,葉綠素a含量分別降低至0.57,0.85mg/L.基于以上結果,采用對數期EA-1菌液(振蕩培養10h)進行后續溶藻實驗.

2.2.2 EA-1菌液不同投加量對溶藻活性影響 隨著培養時間延長,對照組中葉綠素a含量穩定增加,第6d上升至4.03mg/L.5% 投加量處理組,在共培養6d后,葉綠素a含量降低至0.86mg/L.10% 和15%投加量處理組則表現出顯著溶藻活性,共培養3d后,葉綠素a含量迅速降低至0.28和0.19mg/L,基本實現完全溶藻,共培養6d后,葉綠素a含量降低至0.09, 0.05mg/L.當EA-1菌液投加量從10% 提高到15%時,溶藻活性提升不明顯,且從共培養2d后開始,10%和15%處理組中葉綠素a含量未表現出顯著性差異,說明初始葉綠素a含量為1.63mg/L時,10% 投加量足以實現銅綠微囊藻的完全裂解.基于以上結果,采用10% 投加量進行后續溶藻實驗.

圖5 初始葉綠素a含量對溶藻活性影響

2.2.3 初始葉綠素a含量對溶藻活性影響如圖5所示,當OD680=0.2,初始Chl-a=0.69mg/L,細胞密度=5.5′106cells/mL時,溶藻效果顯著,共培養3d后,葉綠素a含量迅速降低至0.07mg/L,抑制率達到97.2%,實現完全溶藻.當OD680=0.4,初始Chl-a=1.43mg/L,細胞密度=1.1′107cells/mL時,共培養3d后,葉綠素a含量迅速降低至0.14mg/L,抑制率為94.2%,同樣實現3d內完全溶藻.當OD680=0.6,初始Chl-a=2.39mg/ L,細胞密度=1.9′107cells/mL時,抑制率隨著溶藻時間延長逐步上升,共培養6d后,葉綠素a含量降低至0.74mg/L,抑制率為84.1%.以上結果表明,當葉綠素a含量低于1.43mg/L時,10%()EA-1菌液投加量可實現3d內完全溶藻,說明EA-1 對銅綠微囊藻具有良好的溶藻能力.

2.3 溶藻模式

共培養6d后,對照組、原菌液、無菌濾液和重懸菌體處理組的葉綠素a含量和抑制率如圖6所示.各組組間葉綠素a含量存在顯著性差異,對照組中,葉綠素a含量從1.48mg/L上升至3.68mg/L,原菌液和無菌濾液處理組中,葉綠素a含量分別降低至0.10mg/L和0.51mg/L,溶藻率分別為97.0%和86.1%.去離子水菌體重懸液處理組表現出最差溶藻效果,溶藻率僅為24.7%(=6d).以上結果表明,EA-1主要通過分泌胞外溶藻物質間接破壞銅綠微囊.

圖6 EA-1對銅綠微囊藻溶藻模式

不同大寫字母表示各組組間葉綠素a含量存在顯著性差異

2.4 藻細胞丙二醛含量和抗氧化酶活性變化

2.4.1 丙二醛(MDA)含量 脂質過氧化產物MDA可反應機體內膜脂過氧化程度,是評估氧化損傷嚴重程度的重要指標,能夠間接地反應機體受自由基攻擊的嚴重程度[18].如圖7A所示,對照組中,MDA含量保持在較低且相對穩定水平,整體在0.06～ 0.14nmol/mg蛋白質范圍內波動,說明其膜脂過氧化保持在較低水平.不同投加量處理組中,MDA含量在處理過程中始終存在顯著性差異,5%實驗組中, MDA含量總體呈上升趨勢,第6d上升至0.47nmol/ mg蛋白質,10%和15%實驗組中,MDA含量急劇上升,共培養5d后達到最高值,分別為0.83和0.95nmol/mg蛋白質,為對照組的8.8和10.1倍.以上結果表明,銅綠微囊藻細胞在外來EA-1無菌濾液壓力下受到不同程度的氧化攻擊,且投加量越高,膜脂過氧化損傷程度越嚴重.

2.4.2 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性 當細胞遭遇不利環境時,會產生大量活性氧(ROS),ROS的過量積累會導致脂質降解,蛋白質變性和DNA異構,引起嚴重的氧化損傷并導致藻細胞死亡[19].SOD,CAT和APX抗氧化酶共同構成了藻細胞氧化應激系統的第一道防線,其中,SOD催化超氧陰離子(O2-)快速歧化為過氧化氫(H2O2),隨后,CAT和APX則會立即將H2O2降解為水,使細胞內ROS維持在較低水平[20].如圖7B所示,對照組中,SOD活性保持在較低且相對穩定水平,整體在20.9至28.2U/mg蛋白質范圍內波動.5%,10%和15%實驗組在共培養初期SOD活性均顯著上升,表明銅綠微囊藻細胞激發了自我防御系統.5%處理組SOD活性在第4d上升至最大值,為58.4U/mg蛋白質,10%和15%處理組SOD活性在第3d上升至最大值,達到83.0和93.3U/mg蛋白質,為對照組的2.95和3.31倍.隨后,10%和15%處理組SOD活性迅速下降,共培養6d后,SOD活性降低至29.4和21.8U/mg蛋白質.如圖7C所示,對照組中CAT含量在10.6～ 16.0U/mg蛋白質范圍內波動. 5%,10%和15%實驗組中,CAT活性呈現先上升后下降趨勢,5%實驗組在第4d上升至最大值,為27.1U/ mg蛋白質,10%和15%實驗組在第3d上升至最大值,達到43.2和48.3U/mg蛋白質,為對照組的3.3和3.7倍.共培養6d后,CAT活性降低至最低值,分別為15.9、28.2、23.5U/mg蛋白質.如圖7D所示,APX活性變化趨勢與SOD,CAT相似,對照組中,APX活性在0.22～0.35U/mg蛋白質范圍內波動.5%,10%和15%實驗組中,APX活性在共培養3d后上升至最高值,分別為0.84,1.33和1.52U/mg蛋白質,共培養6d后,降低至最低值,分別為0.41、0.77和0.89U/mg蛋白質.以上結果表明,溶藻菌EA-1分泌的胞外溶藻物質對藻細胞造成了氧化脅迫,藻細胞則迅速啟動氧化應激系統以抵抗EA-1引起的細胞損傷,使得實驗組中SOD,CAT和APX抗氧化酶活性急劇增加;隨著共培養時間延長,SOD、CAT和APX抗氧化酶不足以清除過量產生的ROS,導致藻細胞受到不可逆的氧化損傷,防御系統嚴重崩潰,酶活性喪失,從而促使藻細胞死亡.

不同大寫字母表示各組組間MDA含量和抗氧化酶活性存在顯著性差異,不同小寫字母表示各組在不同處理時間下MDA含量和抗氧化酶活性存在顯著性差異,相同字母表示無顯著差異

2.5 溶藻產物胞外溶解性有機物(EDOM)組成變化

溶藻過程中銅綠微囊藻胞外有機物組成變化如圖8所示.一般認為,銅綠微囊藻有機物中含有蛋白質、氨基酸和腐殖酸類等物質[13].對照組光譜中檢測到激發和發射(x/m)中心位置為280/335nm的類色氨酸熒光峰(FL-a),此類物質為溶解性的微生物代謝產物,例如含氮物質和芳香族氨基酸,可能是藻細胞的代謝產物[21].與對照組相比,5%實驗組,除檢測到FL-a外,還檢測到x/m中心為260/440nm的類富里酸熒光峰(FL-b)和x/m為340/440nm的類腐殖酸熒光峰(FL-c),類富里酸和類腐殖酸物質是微生物對大分子有機物或藻細胞的降解產物,且這類物質不能被溶藻菌作為營養物質吸收[22].10%和15%高濃度處理組,除檢測到FL-a、FL-b和FL-c外,還出現了x/m為230/330nm的類蛋白熒光峰(FL-d)[13].且隨著EA-1投加量增高,溶藻產物DOM中類富里酸(FL-b),類腐殖酸(FL-c)和類蛋白物質(FL-d)熒光峰強度呈增強趨勢.以上結果表明,EA-1破壞了銅綠微囊藻細胞并釋放了藻細胞胞內有機物,藻類溶解產物主要為類富里酸、類腐殖質和類蛋白等物質,且投加量越高,藻細胞破壞和降解程度越嚴重.

圖8 銅綠微囊藻胞外溶解性有機物(DOM)組成變化

2.6 銅綠微囊藻細胞形態變化

經腸桿菌EA-1處理后,銅綠微囊藻905細胞表面形態變化如圖9所示.對照組中,銅綠微囊藻細胞呈球形或近球形,表面飽滿且光滑,呈現健康的細胞形態特征,無菌濾液處理組中,藻細胞表面出現明顯的褶皺,內陷和萎縮現象.以上結果表明,EA-1無菌濾液脅迫下,銅綠微囊藻細胞受到嚴重破壞.

圖9 銅綠微囊藻細胞形態變化

圖A-C為對照組藻細胞;圖D-F為實驗組藻細胞

2.7 銅綠微囊藻超微結構變化

經EA-1無菌濾液處理后,銅綠微囊藻905超微結構變化如圖10所示.對照組中,藻細胞呈現出完整且健康的結構特征,膠質層和細胞壁緊密貼合,膜狀光合片層和類囊體結構完好,多聚磷酸鹽等營養物質顆粒分布在細胞質中.暴露于EA-1無菌濾液3d后,藻細胞結構發生顯著變化,膠質層與細胞壁分離,膜狀光合片層變得松散和不規則,內部結構開始被破壞,內含物被部分降解.隨后,藻細胞破壞程度進一步加劇,光合片層結構基本消失,DNA核物質和多聚磷酸鹽等營養物質顆粒被降解,藻細胞內部結構被完全破壞,藻細胞死亡.

圖10 銅綠微囊藻細胞超微結構變化

圖A-D為對照組藻細胞;圖E-L為實驗組藻細胞

3 結論

3.1 從廣州流花湖(重度富營養化湖)區域土壤中分離獲得一株對銅綠微囊藻具有溶藻效果的溶藻菌株EA-1,16S rDNA序列分析和系統發育樹表明菌株EA-1屬于腸桿菌屬 (),該菌株16S rDNA序列保存于GenBank數據庫,登錄號為JX983654.

3.2 對數期EA-1菌液表現出最佳溶藻活性,共培養4d后抑制率為93.7%.初始葉綠素a含量為1.63mg/L時,10%()投加量表現出顯著溶藻活性,15% ()投加量對溶藻活性提升不顯著.初始葉綠素a含量為1.43mg/L,細胞密度=1.1′107cells/mL時,10%投加量可實現3d完全溶藻,初始葉綠素a含量為2.39mg/L,細胞密度=1.9×107cells/mL時,6d抑制率為84.1%.

3.3 溶藻菌EA-1 主要通過分泌胞外溶藻物質間接溶藻.EA-1無菌濾液脅迫下,銅綠微囊藻細胞MDA含量急劇上升,表明藻細胞遭受嚴重脂質過氧化損傷.SOD、CAT、POD和APX活性呈現先顯著上升后下降趨勢,活性上升歸因于銅綠微囊藻細胞自我防御系統被快速觸發并不斷增強,以抵御氧化壓力,避免氧化損傷.活性下降歸因于SOD、CAT、POD和APX酶不足以清除過量ROS抵消氧化壓力,銅綠微囊藻細胞防御系統被破壞,酶活性損傷,藻細胞死亡.

3.4 不同處理組溶藻產物三維熒光光譜研究表明,溶藻產物DOM以類腐殖酸,類富里酸和類蛋白物質為主.

3.5 EA-1無菌濾液脅迫下,銅綠微囊藻細胞受到嚴重破壞.破壞過程為:首先,膠質層與細胞壁分離,膜狀光合片層變得松散和不規則,內含物被部分降解,隨后,光合片層結構被徹底破壞,DNA核物質和多聚磷酸鹽等營養物質顆粒被降解,最后,藻細胞內部結構被完全破壞,藻細胞死亡.

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Isolation and identification of an algicidal bacteria strain of EA-1and algicidal characteristics on.

LU Lu1, MA Jin-ling1, NIU Xiao-jun1,2*, ZHANG Dong-qing2, ZHENG Xiao-xian1, LIN Zhang1

(1.School of Environment and Energy, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China；2.Guangdong Key Laboratory of Pollution Process and Control in Petrochemical Industry, School of Environmental Science and Engineering, Guangdong University of Petroleum and Chemical Technology, Maoming 525000, China)., 2021,41(11)：5372～5381

An algicidal bacterium EA-1was isolated from Liuhua Lake in Guangzhou. The 16S rDNA analysis showed that the strain EA-1belongs to the genussp. The algicidal efficiency and mechanism ofsp. EA-1onwas studied. The logarithmic phase EA-1exhibited the best algicidal effect. A 10% inoculation of EA-1could achieve a complete lysis againstwithin 3days with the initial Chl-a content of 1.43mg/L. An inhibition rate of 84.1%±1.3% (=6d) was attained when the initial Chl-a content reached 2.39mg/L. EA-1lysed algae by secreting extracellular algicidal substances. The physiological and biochemical responses indicated that algae suffered serious lipid peroxidation, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX) activities increased dramatically first and decreased subsequently under the oxidative stress of EA-1sterile filtrate. Three-dimensional fluorescence spectroscopy (EEM) analysis showed that the algae lysates were humic acid-like, fulvic acid-like and protein-like substances. Scanning electron microscopy (SEM) showed that the surface of algae cells appeared wrinkled, invaded and atrophied. Transmission electron microscopy (TEM) showed that the destruction process of algae was as followed: first, the colloidal layer was separated from the cell wall, the photosynthetic lamellae became loose and irregular, the contents were partially degraded. Subsequently, the photosynthetic lamellae were completely destroyed, the DNA nuclear material and nutrient particles such as polyphosphate were degraded, the internal structure of algae cells was completely destroyed and the algae cells died.

；；algicidal characteristics；physiological response；cell morphology；cell ultrastructure

X172

A

1000-6923(2021)11-5372-10

盧 露(1996-),女,湖北十堰人,華南理工大學碩士研究生,研究方向為溶藻微生物及控藻技術研究.

2021-04-01

廣東省自然科學基金(2017A030313239)

* 責任作者, 教授,xjniu@scut.edu.com