熒光RNA：點亮神秘的基因組暗物質

左方婷 楊弋

中心法則由弗朗西斯·克里克（F. Crick，1962年諾貝爾生理或醫(yī)學獎獲得者）于1958年提出，并于1970年豐富完善后在《自然》雜志（Nature）發(fā)表[1]。中心法則闡明了DNA、RNA以及蛋白質三者之間的關系：DNA可自行復制，并將遺傳信息傳遞給RNA，再由RNA傳遞給蛋白質。無論是DNA還是蛋白質，在生命活動中都起到無可替代的作用，而起遺傳信息傳遞的RNA則看起來平平無奇。其實這種過分簡化的遺傳信息傳遞流程忽略了RNA在其中扮演的角色。由于長期以來人們對RNA的了解僅浮于表面，在活細胞上也難以對RNA進行直接動態(tài)的觀察，所以RNA，特別是種類繁多的非編碼RNA也常被比喻成基因組中的暗物質。

研究RNA的意義

有關基因組學的深入研究表明：人類的大多數基因組被轉錄成RNA，但只有小部分被翻譯成蛋白質。初代中心法則中的RNA即指這種可以被翻譯成蛋白質的RNA，稱為編碼RNA。我們所熟知的信使RNA（messenger RNA， mRNA）就是編碼RNA。通過對mRNA示蹤，研究mRNA在細胞內的定位和轉運，可以幫助科研人員獲得更多關于mRNA的信息。改變RNA的定位可能會引起疾病的發(fā)生。例如，罹患脆性X染色體綜合征的患者常表現出學習和記憶障礙。這是因為患者發(fā)生基因突變，缺失與mRNA轉運相關的FMRP蛋白質，導致mRNA無法正確定位而引起疾病。因此，通過對RNA動態(tài)成像可以為了解該疾病或其他類似疾病的機理提供新的見解。

除mRNA起到傳遞遺傳信息的功能外，RNA家族里還存在大量非編碼RNA（non-coding RNA， ncRNA）。細胞中含量最高的核糖體RNA（ribosomal RNA， rRNA）和轉運RNA（transfer RNA， tRNA）都屬于非編碼RNA，它們都能從基因組上轉錄出來，但是不翻譯成蛋白質。此外，ncRNA還包括參與mRNA剪接的小核RNA（small nuclear RNA， snRNA）、參與RNA修飾的小核仁RNA（small nucleolar RNA， snoRNA），以及近年來發(fā)現的環(huán)狀RNA（circular RNA， circRNA）、長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA， lncRNA）及microRNA等。大多數的ncRNA都是神秘的，與mRNA不同，ncRNA的序列僅能為它們潛在的功能提供很少的信息。因此，在細胞中對它們進行示蹤顯得尤為重要。其中，可以通過成像確定ncRNA的亞細胞器定位，從而對它們的功能進行預測。例如，細胞核中的ncRNA可能在調節(jié)基因轉錄中發(fā)揮功能，而細胞質中的ncRNA可能會影響該區(qū)域的其他過程。除此之外，對特定位置或結構的ncRNA的遷移進行動力學追蹤，如細胞核中的卡哈爾體（Cajal body）或細胞質中的P小體（P-bodies），都可用于預測ncRNA的功能或調節(jié)通路。

研究RNA的生物學功能意義深遠，它能幫助我們逐步揭開神秘的基因組面紗，更好地了解生命活動的本質。但是目前在研究RNA生物學功能上面臨著巨大的挑戰(zhàn)，缺乏能夠在活細胞中高效工作的RNA可視化工具便是一個技術瓶頸。

熒光RNA的開發(fā)背景

提到RNA的可視化工具，則不得不提到蛋白質的可視化工具，其中遺傳編碼的熒光蛋白絕對占有重要的一席之地。2008年，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP）的發(fā)現者下村修（O. Shimomura）、發(fā)現GFP具有熒光標簽價值并將GFP的編碼基因成功表達在原核模式生物的查爾菲（M. Chalfie），以及對GFP加以改造得到一系列不同熒光光譜的熒光蛋白并推動其廣泛使用的錢永健，因為熒光蛋白技術的開發(fā)，共同獲得該年度諾貝爾化學獎。

綠色熒光蛋白來自維多利亞多管發(fā)光水母，野生型綠色熒光蛋白由238個氨基酸構成。晶體學研究表明，綠色熒光蛋白是一個由11個β折疊環(huán)繞構成的桶狀結構，生色團分子被α-螺旋固定在桶狀結構的中心。該生色團由Ser65-Tyr66-Gly673個氨基酸（絲氨酸—酪氨酸—甘氨酸）殘基通過自催化反應形成，系統將其命名為4-羥基亞芐基—咪唑啉酮（4-hydroxybenzlidene imidazolinone，簡稱HBI）[2]。化學合成的HBI沒有熒光，這是HBI自身特性造成的：當HBI在水溶液中，分子將主要圍繞結構中的乙炔橋進行類似“呼啦圈旋轉”的運動，使得激發(fā)光能量以非輻射衰減的方式消散，宏觀表現為受激發(fā)時不會發(fā)出熒光。而當HBI固定時（正確折疊的GFP中HBI被蛋白質結構固定），分子內運動被阻止，導致其無法通過分子運動而只能以輻射的方式耗散能量，宏觀表現為受激發(fā)時發(fā)出熒光。

熒光蛋白可以說是大自然贈予人類的禮物，它的出現將“死物學”變成了真正的“生物學”。它發(fā)出的熒光猶如明燈，照亮生命體在細胞、分子層面的諸多黑暗角落，正如錢永健教授所言，熒光蛋白將生命活動這部晦澀的小說改編成了一部生動的電影。

自然界中存在天然的熒光蛋白，但尚未發(fā)現天然的熒光RNA。所以在RNA早期研究中，科研人員另辟蹊徑，開發(fā)出一系列基于熒光蛋白的RNA示蹤工具，即RNA結合蛋白—熒光蛋白系統（RNA binding protein-fluorescent protein， RBP-FP）。其中，基于噬菌體得到的MCP-FP系統最早被開發(fā)出來且應用最為廣泛。該系統來源于噬菌體，MS2蛋白是一種噬菌體衣殼蛋白，它也是一種天然存在的RNA結合蛋白，可以特異性識別一段由19個堿基形成的莖環(huán)結構RNA，即MS2結合位點，并與之相互作用。在使用時，通常在靶標基因上融合一組MS2結合位點，同時將MS2衣殼蛋白與熒光蛋白融合，將兩者在同一個細胞中共表達。由于MS2結合位點與MS2蛋白具有較高的親和力，與靶標RNA融合的MS2結合位點會拉近融合有熒光蛋白的MS2衣殼蛋白，從而使靶標基因被“照亮”，實現對細胞內靶標RNA定位和動態(tài)變化的實時監(jiān)測。在這之后，科研人員不斷豐富與優(yōu)化，相繼開發(fā)了Cys4、PP7、λN22、Cas等諸多基于RNA結合蛋白的RNA成像系統[3]。

上述方法其實都還在借助編碼熒光蛋白的這一報告基因，但熒光蛋白自身存在的劣勢，如熒光團成熟需要時間且需要氧氣參與，以及系統不可避免的游離熒光蛋白造成的背景信號，都會對示蹤效果產生不利的影響。尚未發(fā)現天然存在的熒光RNA，那我們是否可以根據熒光蛋白發(fā)光原理人工“制造”熒光RNA，從而實現對靶標RNA的直接示蹤呢？

答案是肯定的。錢永健教授除了在熒光蛋白領域造詣頗高，在熒光RNA領域也是開山鼻祖。他在2003年報道了首個在結合RNA后可以發(fā)出熒光的熒光團，該熒光團是一種三苯甲烷染料——孔雀綠（malachite green， MG）[4]。然而，有研究報道，MG染料在熒光輻照后會產生活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）而對細胞產生明顯的毒性。雖然MG染料并不能應用于活細胞內的RNA成像，但這也為熒光RNA的出現提供了新的想法。科研人員可以合成類似于熒光蛋白生色團的熒光團，再結合20世紀90年代發(fā)展起來的指數富集的配體系統進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術，經體外人工篩選得到可以與熒光團結合的RNA適配體。RNA適配體是一段RNA序列，經A-U、C-G、G-U堿基配對形成較為復雜的空間結構。當熒光團分子嵌入RNA適配體形成的結合口袋時，分子內運動被阻礙，從而實現人造“熒光RNA”。這個想法雖然聽起來不難，但是實際操作起來還是會面臨許多意想不到的問題。所以時隔8年后，第一個可以應用于哺乳動物細胞的熒光RNA才被《科學》雜志（Science）正式報道。

熒光RNA的發(fā)展歷程

2011年，來自美國康奈爾大學的一個課題組首先報道了一個名叫Spinach-DFHBI的復合物[5]。因其受激發(fā)后發(fā)出綠光，發(fā)射波長位于505 納米，因而該RNA適配體取名“Spinach”，中文譯為“菠菜”。生色團DFHBI是在綠色熒光蛋白生色團HBI的基礎上加以修飾而得到，因此它也被稱為擬熒光蛋白RNA（RNA mimics of fluorescent protein，RMFP）。Spinach雖然實現了在哺乳動物細胞內表達，但由于其是二聚體，在細胞內折疊效率低且熒光弱等，應用十分受限。

但科研人員們并沒有放棄，而是繼續(xù)對Spinach進行優(yōu)化，于2012年報道了性質得到明顯提升的二代菠菜，Spinach2[6]。脆性X震顫/共濟失調綜合征是一種神經退行性疾病，它的發(fā)生常與“有毒RNA”CGG錯誤堿基重復序列相關，即在轉錄過程中，出現長度不等的CGGCGGCGGCGG重復序列，嚴重干擾正常生理功能。利用Spinach2-DFHBI復合物，科研人員可以實現對“有毒RNA”CGG堿基的標記，并且觀察到藥物治療該疾病后CGG堿基重復序列消散的動力學過程。

沒有最好，只有更好，科研之路沒有絕對的頂峰。2014年，在Spinach2的基礎上，科研人員在大腸桿菌中表達突變文庫，結合流式細胞術篩選得到性質更為出色的RNA適配體Broccoli，中文譯為“西蘭花” [7]，并進一步得到優(yōu)化后的生色團DFHBI-1T。由于以上擬熒光蛋白RNA的熒光團都是在GFP生色團基礎上做的化學修飾，因而它們的光譜并沒有發(fā)生明顯變化，無論是“菠菜”還是“西蘭花”，都還屬于“綠色蔬菜”。

波長紅移一直是科研人員不斷拓展的方向，更長的波長不僅穿透力更強，可以對深層組織內的靶標RNA進行示蹤，同時可以在一定程度上避免光毒性及細胞自發(fā)熒光造成的背景噪聲。2017年，依舊是康奈爾大學的那個課題組，他們對紅色熒光蛋白DsRFP生色團進行修飾，得到熒光團DFHO。同時利用SELEX技術篩選得到可以與之結合的RNA適配體，最終得到發(fā)射波長位于545 納米的黃綠色擬熒光蛋白Corn-DFHO，“Corn”中文譯為“玉米” [8]。Corn-DFHO擁有較好的光穩(wěn)定性，可用于對活細胞中轉錄效率的定量分析。

以上擬熒光蛋白RNA生色團的設計思路全部來自熒光蛋白。而與此不同的是，2014年，來自加拿大西蒙弗雷澤大學的課題組利用已知能結合雙鏈核酸的噻唑橙（thiazole Orange， TO1）的優(yōu)勢，對TO1進行生物素（biotin）修飾，并利用微流控技術相結合的SELEX技術，篩選得到了可以結合TO1-biotin的RNA 適配體，開發(fā)了基于花青素染料的熒光RNA，Mango-TO1-biotin[9]。該熒光RNA發(fā)射波長位于535 納米，發(fā)出黃綠色熒光，所以取名“Mango”，中文譯為“芒果”。近年來，他們對Mango進行突變優(yōu)化，得到二代、三代、四代芒果（MangoⅡ、MangoⅢ、MangoⅣ），性能進一步提升。

無論是“菠菜”“西蘭花”“玉米”還是“芒果”，RNA 適配體本身都有一個缺陷，即天生自帶G-四鏈體。而細胞中存在天然識別G-四鏈體的核酸降解酶，這些熒光RNA在細胞中表達后，會很快被細胞識別并降解，這給它們發(fā)揮靶標RNA示蹤功能帶來了非常不利的影響。

2019年，筆者團隊和朱麟勇教授合作開發(fā)了全新的熒光RNA，Pepper-HBC家族[10]。全新設計的熒光團分子HBC，經修飾后可得到HBC系列衍生物，與RNA 適配體Pepper結合后發(fā)出不同顏色的熒光（從485 納米的青色熒光、530 納米的綠色熒光、599 納米的橙色熒光，到620 納米的紅色熒光），因而該RNA適配體起名“Pepper”，中文譯為“辣椒”或“彩椒”。全新理性設計的HBC更易于被鎖定在RNA適配體中，且背景熒光低、無細胞毒性。同時Pepper本身是單體參與結合，不含有G-四鏈體，與HBC的結合力也非常強，可達到納摩爾級。此外，Pepper系列熒光RNA亮度高且穩(wěn)定，無論是在體外還是活細胞內均具有出色的表現，這使得Pepper可實現對不同豐度功能性RNA的示蹤研究，同時不影響它們的空間分布和動態(tài)變化。

研究人員聯用Pepper和熒光蛋白，通過流式細胞術，同時檢測Pepper標記的mRNA及其翻譯的融合熒光蛋白的蛋白質水平，首次實現了大規(guī)模的活體單細胞mRNA的翻譯調控分析。利用Pepper得到的翻譯調控分析數據顯示，人結腸癌細胞HCT-116、人胃癌細胞MKN-45、人神經膠質瘤細胞U-87、人食管癌細胞TE-1和人前列腺癌細胞PC-3等癌細胞系的R2數值（通過米氏方程擬合得出，表示相關性強度）均低于正常細胞系（小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3和人胚腎細胞293T/17）的R2數值，這意味著在癌細胞中翻譯調控存在失衡。此外，研究者們還利用Pepper實現了活細胞中RNA的動態(tài)追蹤。結果顯示，腫瘤細胞中蛋白質與其mRNA的含量存在著很弱的相關性，換而言之，腫瘤細胞中的翻譯過程是嚴重失調的。這為腫瘤的診療提供了一種全新的思路和方法。

聯用Pepper和CRISPR基因標記系統，可實現對不同基因位點的多色且可快速切換熒光的成像標記及分析。此外，Pepper620發(fā)射波長達到紅色波段620 納米，熒光亮度高、光穩(wěn)定性強，可用于結構光照明超分辨成像（structure illumination microscopy，SIM），這也是首次實現熒光RNA對光學衍射極限的突破，為功能性天然RNA的超分辨成像提供新的強有力工具。因此，這些出色的性能使Pepper-HBC成為目前可以在哺乳動物細胞中對靶標RNA進行示蹤的最佳熒光RNA。

熒光RNA的未來發(fā)展

熒光蛋白的發(fā)現源于人類對自然的觀察與好奇，而熒光RNA的發(fā)展過程則表現出人類的理性思考，以及對生命本質的不斷探索。從第一個可以在哺乳動物細胞中實現標記的熒光RNA算起，熒光RNA的發(fā)展還不足10年。這得益于其站在巨人的肩膀上，趕在生命科學蓬勃發(fā)展的黃金時代。Pepper作為目前表現效果最好的熒光RNA，除可用于活細胞內靶標RNA的示蹤，進行基礎的科學研究外，未來還可用于發(fā)展任意標靶的檢測探針，為活細胞與活體生物傳感、即時診斷，甚至實時診斷技術的發(fā)展提供新的機遇。

實際上熒光RNA的發(fā)展仍處在起步階段，未來的熒光RNA需朝著遠紅、甚至近紅外波段發(fā)展，提高亮度與穩(wěn)定性，以實現單分子、超分辨成像，實現活體動物的靶標RNA實時監(jiān)測，直至最終應用于臨床。熒光RNA歸根結底是一門生物技術，一個工具，如何用好這個工具推動生物學向前發(fā)展，解決人類在疾病診療中遇到的問題，真正造福于全人類，這需要各領域科研人員的共同努力。本文介紹的都是十分經典且成功的熒光RNA代表，其實還有數以億計的候選熒光RNA被淘汰和淹沒。科學之路從來都不會一帆風順，也許真正值得銘記的是那些已被遺忘的無數次的失敗與嘗試，真正偉大的是那些在黑暗中仍舊不斷求索的人。

[本文得到國家重點研發(fā)計劃（2017YFA050400、2019YFA0904800），國家自然科學基金（91857202、21937004、31971349、31600688）和上海市科學技術基金（18JC1411900）的資助。]

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關鍵詞：熒光RNA 熒光蛋白 活細胞成像 ■