植物微核技術監測土壤農藥污染研究

李文義，方睿霞，尹鵬宇，楊 志，高云濤，熊華斌，李曉芬，劉滿紅

(1.云南民族大學 民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500；2.云南民族大學 云南省跨境民族地區生物質資源清潔利用國際聯合研究中心，云南 昆明 650500)

土壤環境質量與農產品質量、人類健康及經濟社會的可持續發展息息相關，是生態文明建設的重要內容[1-3].土壤是農藥在環境中的“儲存地”，使用在農田中的農藥絕大部分殘留在土壤環境介質中，導致相關污染物在土壤環境中的逐步富集.農藥殘留的增加不僅使病蟲害的抗性增強，迫使農藥的使用量愈來愈大，環境的污染也愈來愈嚴重，且使農作物和食品中的殘留量劇增，對人類的健康造成威脅[4].

微核(micronucleus，MCN)是指大小小于主核1/3的圓形或橢圓形的核小體，其位于細胞質中獨立于主核[5]，由于環境因子干擾使染色體發生斷裂或丟失，細胞進入下一次分裂時斷裂的染色體沒有著絲點，游離在細胞質中，不能隨有絲分裂進入子細胞，從而形成大小不等的小核[6].可通過觀察并統計微核的數量，計算其微核率以此評估環境污染導致染色體畸變的程度，間接地體現環境污染的程度.該技術測定的是細胞染色體受損傷的程度，更接近于污染物對生物和人類的危害情況.以植物微核技術監測環境污染, 具有操作簡單、快速、靈敏、經濟等特點，實驗結果可靠性強，具有較強的實用性[7-8].微核的應用近年來已有部分研究[9-13]，但目前微核技術技術尚未普及和發揮其應有的作用，特別是監測土壤污染的技術本身也待完善.

近年來，隨著土壤污染的加劇，國家對土壤環境保護、土壤環境監測逐步加強[14].土壤污染通常具有復合污染的特點,但現行標準中監測污染物的數量不足，尤其有機污染物數量過少[15]，土壤環境質量監測的評價及分析方法等技術體系尚不健全[16-17].利用微核土壤環境監測的相關研究較少，且未對土壤中農藥監測形成較好的相關性分析及評價系統，本文擬利用植物微核技術監測分析農藥土壤污染，并將微核監測結果進行分析，以期為土壤污染監測和評價提供參考.

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

可自動拍照光學顯微鏡、分析天平、恒溫培養室.

1.2 實驗材料

蠶豆(昆明呈貢農資市場)、15 cm培養皿、70%啶蟲脒(Acetamiprid)、甲醇、冰醋酸、濃HCl(均為分析純)、鹽酸(6 mol/L)、卡諾氏固定液、醋酸洋紅染色液、姬姆薩染液、改良苯酚品紅染液、卡諾氏固定液(甲醇和冰醋酸體積比為3∶1).

1.3 實驗過程

1.3.1 蠶豆浸種催芽

選擇大小均勻、無質變的飽滿蠶豆，洗凈后用純水常規浸種、催芽 36 h，使蠶豆充分吸水膨脹，每間隔 12 h 換一次水.之后將蠶豆置于 16 ℃(蠶豆發芽的最適溫度)的恒溫培養室中培養 24 h，再繼續用蒸餾水培養使其長出 1.0 cm 左右的初生根.

1.3.2 染毒液配制

根據啶蟲脒(Acetamiprid)的使用方法(在50～100 mg/L 的濃度下，可有效地防治棉蚜，菜蚜、桃小食心蟲等，以 500 mg/L 濃度施藥可防治光潛蛾、桔潛蛾以及梨小食心蟲等，并可殺卵)，實驗使用 200 mL 溶劑，稱取啶蟲脒不同質量并配制成5個不同質量濃度的染毒液，即：0、35.71、71.43、285.71、714.29 mg/L，亦即：0、35.71、71.43、285.71、714.29 mg/300 g土,其中 0 mg/L 是使用蒸餾水作為陰性對照(CK).

1.3.3 土壤染毒

將各濃度的染毒液，定量、均勻地噴灑到經 2 mm 過篩處理后的 300 g 土壤中，將濕團與細土揉勻，置于 15 cm 培養皿中，平衡處理 12 h 以上待用.

1.3.4 蠶豆染毒及修復培養

分別選取胚芽發育良好(根尖長短、粗細一致)的蠶豆栽種于培養皿中，染毒18、24、48和 72 h 后，然后用蒸餾水沖洗干凈，并用蒸餾水浸洗3次，每次 3 min，在室溫下用蒸餾水進行修復培養12～24 h.

1.3.5 制片及鏡檢

1) 取材及固定 用剪刀剪下染毒后的蠶豆 1 cm 根尖，再用蒸餾水洗凈根尖，用新配卡諾氏固定液固定2～24 h，使細胞的分裂處于停滯狀態.

2) 解離 用蒸餾水浸洗固定好的根尖2 次，然后根尖用 6 mol/L 的鹽酸解離15～30 min.

3) 制片 將解離后的蠶豆根尖用蒸餾水浸沒幼根3 次，每次 2 min，切取1～2 mm 蠶豆根尖置于載玻片上，加2滴醋酸洋紅染色液，染色 15 min，蓋上蓋玻片，覆一層吸水紙，常規壓片.

通過預實驗可得，當蠶豆染毒時間達到 72 h 時，蠶豆根尖出現萎蔫的情況.考慮此情況，染毒18、24和 48 h 時選取根尖和靠近根尖的部位制片觀察，而染毒 72 h 時均選取靠近根尖的部位制片觀察.

4) 鏡檢 首先在低倍鏡下找到分生組織細胞分散均勻，分裂相對較多的部位，再轉至高倍鏡觀察.

圖1 蠶豆根尖細胞微核

每個根尖計數 1 000 個細胞中的微核數并進行記錄，測定其微核千分率MCN‰.

2 結果與分析

2.1 不同染毒時間蠶豆根尖長勢情況

在 23 ℃ 時,蠶豆細胞周期為 18 h.將蠶豆染毒18、24、48和 72 h，由表1可知，18～48 h 蠶豆根尖長勢良好，蠶豆染毒達到 72 h 時，蠶豆根尖出現萎蔫的情況.染毒作用對蠶豆根尖影響較影響.

表1 4個染毒時間蠶豆根尖長勢情況

2.2 不同染毒時間采用不同部位制片的微核率

通過在同一濃度和時間培養蠶豆根尖采用根尖與靠近根尖部位制片，MCN‰產生基本相同.蠶豆經啶蟲脒同一濃度土壤染毒18、24和 48 h 后，MCN‰隨染毒時間的增長而增大.在同一染毒時間下經不同濃度的土壤染毒，MCN‰隨濃度的升高而增大，且MCN‰均有明顯的升高.

當染毒時間達到 72 h 時，蠶豆根尖出現萎蔫現象，故使用靠近根尖部位制片觀察.由表2可知，蠶豆通過染毒 72 h 后微核率隨著啶蟲脒在土壤中的濃度增大而逐漸增大.

表2 蠶豆染毒18、24、48、72 h微核率

圖2 啶蟲脒不同濃度、不同染毒時間對蠶豆根尖的誘變效應

綜上所述，蠶豆微核率隨染毒時間的增長而增大.在同一染毒時間下經不同濃度的土壤染毒，MCN‰隨濃度的升高而增大.染毒時間18～48 h 的蠶豆，使用根尖和靠近根尖部位制片觀察所得到的微核率差別不大，說明經過土壤染毒誘使根尖部位和最靠近根尖部位產生微核的機率基本相同.

3 結語

蠶豆隨農藥土壤處理時間的增長，蠶豆微核率呈增長趨勢.當蠶豆染毒時間達到 72 h 時，蠶豆根尖出現萎蔫的情況.因此，監測中蠶豆根尖染毒時間為18～72 h 為宜.蠶豆微核率隨染毒時間的增長而增大.在同一染毒時間下經不同濃度的土壤染毒，MCN‰隨濃度的升高而增大.因此，使用啶蟲脒處理蠶豆產生的MCN‰隨著染毒液濃度的增大和染毒時間的增長，MCN‰均有明顯的升高，表明啶蟲脒對蠶豆根尖細胞具有較強的誘變效應.經過土壤染毒誘使根尖部位和最靠近根尖部位產生微核的機率基本相同.