急性骨骼肌損傷實驗動物模型種類和選擇

嚴名揚，唐臻一

（天津市北辰區中醫醫院急診科1，骨傷科2，天津 300400）

骨骼肌是人類自主活動得以實施的主要物質基礎和功能保障。不僅作為行動力量的提供者與協調者，而且骨骼肌功能的正常發揮能有效表現出生命體存在的現實價值。在各種類型創傷中，肌肉組織損傷所占的比率相對最高[1]。急性骨骼肌損傷（acute skeletal muscle injury）發生于各種機制，包括直接原因（挫傷、擠壓、拉傷、扭傷、撕裂傷）和間接原因（例如缺血、神經功能障礙）[2-4]。由于損傷后肌肉組織血腫機化、瘢痕修復，對活動能力、生活質量構成現實的威脅；因此研究骨骼肌損傷的發病機制，了解其病理特點和臨床轉歸，探討相關的預防、治療和康復措施等，一直是臨床研究的一項重要課題[5，6]。對骨骼肌損傷發病機制的實驗研究需要建立在良好的損傷模型基礎上，各種動物模型的建立適用于不同的研究目的。針對不同類型的急性骨骼肌損傷模型，各損傷造模機制、肌群、實驗動物種屬等方面的選擇成為課題，本文現對急性骨骼肌損傷實驗動物模型種類和選擇進行綜述，旨在為此類實驗研究的開展提供參考。

1 骨骼肌急性損傷的動物實驗模型

在對骨骼肌損傷的研究中，準確地建立、復制出與人類疾病一致的動物損傷模型，是相關研究過程中的重要環節。有關骨骼肌損傷的實驗研究，主要針對于骨骼肌疾病的病因研究，故實驗性動物模型多采用物理、化學及生物學等損傷因子，對骨骼肌直接實施損傷，以此模擬并研究骨骼肌疾病的病理過程。動物實驗模型可復制出骨骼肌急性損傷的典型病理變化，對深入骨骼肌損傷的實驗研究具有重要的現實意義[7]。目前根據損傷病因、實際操作等情況，常見的急性骨骼肌損傷模型采用的技術有：毒素注射、重物擠壓缺血、缺血再灌注損傷（橡皮筋/止血帶阻斷缺血）、失神經支配、冷熱損傷、重物墜落、揮錘、銳性不橫斷切割、游泳/上下坡跑、電刺激損傷等張收縮、拉伸、基因敲除或細胞等成分剔除，其它疾病引起的骨骼肌損傷模型如周圍血管疾病、COPD 等。常見的急性骨骼肌損傷模型有毒素注射模型、肌肉拉伸實驗模型、電刺激損傷模型、下坡跑骨骼肌損傷模型、骨骼肌撞擊傷模型、缺血再灌注損傷模型、神經損傷模型等，這些模型的制作為急性骨骼肌損傷的研究奠定了實驗基礎。每項實驗模型技術均對應于相應的動物模型，所誘導的模型建立在不同病因基礎上，也表現出各自的特點。

1.1 開放性損傷模型

1.1.1 開放性肌肉牽拉傷模型 肌肉牽拉傷是因為肌肉主動強烈收縮（主動向心收縮）或被動過度拉長造成（被動離心收縮）引起的肌肉微細損傷，甚至肌肉部分撕裂或完全斷裂[8]。這是一種最常見的骨骼肌急性損傷，其實質是肌肉組織承受過度載荷所致，易發于雙關節肌或多關節肌，尤其是發生在快縮肌比例高的肌肉上（如腓腸肌），且肌肉拉傷的位置多發生于遠端的肌肉肌腱移行部位。

常規對大鼠的目標肌肉進行遠端外科手術，暴露其肌腱，特制夾具夾持離斷的肌腱，以6 cm/min拉伸速度實施拉伸，用示波器顯示并記錄載荷—變形曲線，當曲線進入平臺期，拉伸停止；拉伸結束后將肌腱縫合到伸肌支持帶上，并縫合刀口，完成目標肌肉被動拉伸實驗模型。有研究運用定負荷自由落體的方法復制了肌肉拉傷[8]，其具體方法如下：大鼠麻醉后，將準備拉傷一側的下肢膝關節固定，踝關節游離，用電刺激儀刺激腓腸肌兩端，引起腓腸肌強直收縮，使踝關節跖屈。與此同時，一重物從固定高度自由下落，通過系在動物足上尼龍繩上的銅絲，以一個基本恒定的初始沖量迫使踝關節迅速背屈，腓腸肌離心收縮而被拉傷。拉伸載荷達到極限斷裂閾值80%時，其肌纖維斷裂可蔓延到遠端肌腹部分；拉伸載荷達到極限斷裂閾值90%，肌纖維斷裂進一步向肌腹部分蔓延，并有肌組織的橫向結構和附屬組織（肌外膜、肌束膜、肌內膜）發生斷裂[9]。

1.1.2 骨骼肌割裂傷模型 骨骼肌的斷裂模型常常采用割裂傷技術，肌肉切割傷多由銳器暴力引起，組織斷端比較整齊、血運良好，創面污染情況決定于損傷時的環境，嚴重者可離斷肌肉或肌腱等[4]。該模型不需要借助大型或特殊的儀器設備，易于復制，且損傷后的病理生理變化與拉傷損傷后的一致。對于該項實驗的組織學研究，關鍵是其損傷部位定位準確和一致性的損傷程度。但該模型同樣面臨手術通路所引起的副損傷對模型炎癥反應等相關研究可能存在的不良影響。

該模型的優點是肌肉損傷程度的一致性，為損傷肌肉不同治療措施效果比較研究提供了保證。但存在的問題是與活體肌肉拉傷在生理及力學特性方面發生的形變較大，難以準確反映日常活動、訓練比賽中肌肉拉傷的各種特征。開放性的傷口和操作所引起的炎癥反應，和骨骼肌組織損傷的炎癥反應與損傷修復過程發生相互影響，進而對實驗結果的可靠性產生負面作用；并且拉伸實驗裝置和夾具選擇也對實驗本身產生相關的影響[10]。

1.2 閉合性損傷模型

1.2.1 閉合性電刺激肌肉牽拉傷模型 為消除造模過程中手術操作和皮膚傷口對模型穩定可靠性的不利影響，采用各種電刺激方式的閉合性肌肉牽拉傷模型被開發出來。單向慢性低頻或高頻電刺激導致的電刺激損傷模型，是研究骨骼肌機械性和物理性適應變化的一個很好實驗模型；其變化常在短時間內發生在受刺激的肌肉，在肌肉損傷及神經肌肉功能失調等研究中具有很高的應用價值。張勝年等[11]采取兩根銀質針電極，刺激儀以50 V 電壓刺激脛后肌群強直收縮、踝關節趾屈；同時，拉伸實驗機以0.55 m/s 的速率反向牽拉大鼠足底固定板，迫使踝關節背屈，牽拉小腿三頭肌離心收縮，造成該肌肉急性中度拉傷。

1.2.2 力竭性骨骼肌損傷模型 力竭性骨骼肌損傷是骨骼肌損傷的主要類型之一，多見于周期性的耐力運動項目和長期的肌肉興奮。是因反復運動所致的肌纖維損傷，并且易發于骨骼肌離心運動時相，故下坡跑運動性骨骼肌損傷動物模型，以驅使動物在一定斜度的動物跑臺上進行周期性的下坡跑等訓練方式最為多見。Armstrong RB 等[12]對大鼠在坡度為16°的跑臺上，以16 m/min 的速度持續90 min 下坡跑，導致肌纖維損傷發生，復制出運動性肌肉損傷模型。田野等[13]對大鼠在同樣的環境下，改變下坡跑訓練的持續時間和間隔，復制了力竭性骨骼肌運動損傷模型。劉姣等[14]通過遞增負荷跑臺運動設計一次性力竭運動模型。此外，張宏梅探討了游泳力竭性骨骼肌損傷模型[15]。

在動物下坡跑運動性損傷模型中，肌肉抵抗體質量形成的運動負荷而進行離心收縮做功。動物最主要的工作肌群是前肢的肱三頭肌、前臂屈肌群，故取材以實驗動物的前肢為佳。對于跑臺的斜度，根據Armstrong RB 等[12]的研究，16°是大鼠下坡跑時不打滑的最大斜度，但在實驗研究中，由于跑臺的膠帶質地、材料不同，斜度可以適當調整，斜度越大，模型復制效果應該越好。但這類型模擬的是中輕度的骨骼肌損傷，并在中長期的觀察中，損傷的骨骼肌一般均能自我恢復；對臨床的實際意義不高；并且造模過程時程較長，實際可操作性欠佳。并且不同的運動方式、不同的力竭強度對骨骼肌的損傷和后期修復產生的作用具有差異性[16]。

1.2.3 骨骼肌撞擊傷模型 骨骼肌撞擊傷是鈍性暴力直接作用于機體某部位而引起的肌肉急性損傷，常發生于接觸對抗類體育運動（如足球、籃球、武術等運動）、社會工業生產、公路交通事故中，以大腿和小腿及軀干等部位最為多見。

使用撞擊傷作為骨骼肌損傷的非侵入性模型，在研究免疫系統與肌肉之間的相互作用中是必須的[17]。早期使用重物墜落技術的肌肉挫傷模型已廣泛應用于骨骼肌損傷研究。Bunn JR 等[18]設計了兩個撞擊能量的損傷，表明骨骼肌的損傷程度在一定范圍內與致傷能量成正比，并且高能嚴重的骨骼肌損傷在后期募集的巨噬細胞和成纖維細胞可能是導致骨折延遲愈合和不愈合的原因。Deane MN 等[19]通過對骨骼肌損傷的淺層（近皮下側）和深層（近骨骼側）肌組織的形態學等分析，總結出評價骨骼肌損傷的新模型和方法。嚴名揚等[20]采用具有沖頭定位的撞擊傷器械在腓腸肌建立了嚴重的骨骼肌損傷模型。Paun B 等[21]、吳安林等[22]在兔骨骼肌鈍挫傷模型的制備、打擊力度的關系和分期等方面對該技術進行了具體實施。

但是，這種損傷模型的局限性包括以下幾點。一方面，這些模型并沒有將腓腸肌從下面的骨骼中分離出來，這使得撞擊反應變得復雜，并且常常因為導致的骨折阻礙了嚴重的肌肉創傷的模擬；另一方面，根據能量守恒定律，傷害勢能的參數（質量和高度）在幾種挫傷模型中是不同的，理論上會導致撞擊反應和組織損傷的差異[23，24]。迄今為止，仍缺乏使用具有可變參數的致傷勢能的重物墜落技術對從下方骨骼分離的受損腓腸肌中的撞擊反應的研究。

1.3 特殊損傷模型

1.3.1 缺血再灌注損傷模型 缺血再灌注損傷模型常采用肢體重物持續擠壓和血管持續夾閉兩項技術。骨骼肌常常因長時間缺血而引起組織器官損傷，且再灌注導致組織損傷加重，即所謂的“缺血/再灌注損傷”，而氧自由基則貫穿于這一損傷的全過程。

Akimau P 等[25]使用3 kg 的重物壓迫大鼠小腿6 h、再灌注3 h 的方法設計了擠壓傷模型。通過觀察損傷區域巨噬細胞和形態學等變化，設計了血管持續夾閉通過股動脈閉塞2.5 h，再灌注2 h 建立模型[26]。張景達等人使用無創型動脈夾阻斷右股動脈4 h，灌注24 h 建立缺血模型；并采用缺血和灌注之間，加入“實施4 個循環30 s 再灌注/30 s 缺血”操作，以建立缺血后調適組[27]。

1.3.2 燒傷、毒素損傷模型 da Silva NT 等[2]使用腓腸肌燒傷模型的研究表明炎癥介質COX-2 等的釋放能減輕骨骼肌的退變。同時，采用蛇毒毒素類的心毒素單次肌內注射，引起肌纖維溶解，誘導小鼠急性骨骼肌損傷后再生、修復機制[28]。缺血再灌注模型的建立主要考慮的是缺血時間和再灌注時間對損傷的影響。但通過重物擠壓肢體引起的缺血再灌注損傷，和夾閉血管引起的骨骼肌再灌注損傷，在組織學和全身炎癥反應等方面存在著差異性，并且兩組對應的臨床病癥也有所不同。相對來說，肢體擠壓所造成的損傷更嚴重，更加接近于臨床上的現實狀況。除了缺血本身的完整性以外；其它因素，如遺傳背景等，也會影響急性缺血性肌肉損傷的程度[29]。

2 動物模型和肌肉的選擇

骨骼肌損傷病因的多樣性決定了相關損傷模型的多樣性。對于具體的動物模型的選擇還需考慮以下因素：發生于人類身上的損傷的嚴重程度存在個體差異，如有些模型需要采用有創操作及實驗取材進行的有創操作，這些基礎性的因素使對骨骼肌損傷，特別是進一步闡述諸如巨噬細胞等免疫細胞在骨骼肌損傷、修復過程中發揮的準確作用和調節機制的研究更復雜。并且各物種（包括人類）之間對于損傷的修復也存在著種屬差異，而采用實驗動物難以消除這些差異，此外還涉及到醫學倫理等因素。

2.1 模型選擇 損傷后的炎癥反應是機體啟動修復程序所必須的，因此損傷病灶區的炎癥反應和免疫應答成為了骨骼肌損傷研究的焦點。對于涉及免疫炎癥反應、信號通路等研究的整體而言，骨骼肌損傷模型應盡量減少造模過程中非主體結構的損傷。相對于非侵入性的造模方式，侵入性的（開放傷口/針道）造模方式需在實驗設計上排除侵入操作對實驗目的本身的影響，即使模擬的是開放性損傷類型也應該一樣。

重物墜落技術導致的撞擊傷模型研究應用廣泛，無論是否存在骨骼肌群的暴露，多數研究采用單次撞擊。早期重物墜落技術采用了平滑的撞擊平面，并通過調節墜落高度致損特定的肌肉。有學者使用此類侵入性模型進行了損傷病灶和全身炎癥反應的相關研究。Bunn JR 等[18]的研究顯示，雖然骨骼肌傷后存在IL-1β、IL-6 和TNFα 水平改變，但是該研究缺乏假手術組進行對照，難以說明手術操作本身對相關細胞因子釋放的影響。由于骨骼肌損傷的炎癥反應和手術副損傷的炎癥反應在同時期啟動、活躍，可能進一步影響實驗結果。因此，在探討骨骼肌和免疫系統之間關系需要采用骨骼肌損傷的非侵入性模型進行研究。

非侵入的缺血再灌注損傷模型主要使用重物對肢體的壓迫或夾閉責任的血管等手段導致長時間的血供中斷[25]。造模過程中沒有造成撞擊性暴力損傷，其骨骼肌纖維形態結構在血液灌注前一般能保持初始結構。缺血再灌注損傷和“二次打擊”的研究模型適用于肢體擠壓傷，并更多的用于其對全身其它系統器官的損害的研究。因此不是研究骨骼肌損傷修復機制的理想模型。雖然應用鉗子夾持的擠壓傷能很好的定位目標肌肉和損傷區域，但改方法仍然需要手術暴露，徒手夾持的力量大小也難以統一衡量，且機械性夾持也可能因夾持不均勻而影響研究結果。

重物墜落技術作為常規的骨骼肌撞擊傷模型，具有無創、可調節、操作簡便等特點。但此模型存在設備裝置較復雜不易獲得、擬致傷骨骼肌部位固定欠佳、致傷程度不均勻、容易導致皮膚破損和骨折等問題。為避免開放性造模和肌肉損傷單位的模糊性設計了定位沖頭，該系統引入了一個接觸目標肌肉和起定位作用撞擊沖頭，并且該沖頭的使用還具有緩沖作用，有效降低了高頻撞擊的影響，同時將直接撞擊變為間接撞擊，從而實現了技術的進一步改進。

2.2 肌群的選擇 不同類型肌纖維的血管化程度不同，導致不同的肌纖維類型表現出不同的代謝表型。需氧的Ⅰ型纖維通過高度的血管化為肌纖維提供豐富的血供和營養。相反地，Ⅱb 型肌纖維為非氧依賴型，其毛細血管供應較Ⅰ型纖維明顯減少。雖然整塊肌肉一般由多種肌纖維混合而成，但是其特性會因不同的肌肉、個體差異、物種類型的不同而不同。目前，骨骼肌擠壓傷研究的動物模型主要包括腓腸肌[30，31]和脛前肌[32]。雖然這些肌肉均含有Ⅱb 型肌纖維，但是只有腓腸肌是混合型肌肉，并含有Ⅰ型纖維。此外，腓腸肌形體相對來說較大，適合各種造模操作，而不影響骨骼，對于有利減輕痛苦及倫理審查均有利；此外，還能有效降低因骨折和周圍組織損傷所釋放細胞因子，有利于相關分子生物學的研究。腓腸肌與肱二頭肌形態相似，為扁平的長肌，常在對抗類運動中發生撞擊傷。因此，腓腸肌被認為是研究骨骼肌損傷后機體反應、修復機制的理想肌肉。

受免疫和細胞因子系統的影響，不同的肌纖維類型分泌的細胞因子會有差異，如人類三頭肌、比目魚肌等在休息狀態下時TNFa 和IL-18 只在Ⅱ型纖維中表達，IL-6 主要在Ⅰ型纖維中表達[33]。單個肌肉挫傷后線粒體功能的急性反應在快速纖維、慢速纖維等不同類型肌纖維中表現也不同[34]。此外，肌肉組織在破損、修復和重塑等階段中纖維類型的差異尚需進一步研究。

2.3 實驗動物的選擇 嚙齒動物是目前生物醫學研究中使用最廣泛的模型動物。近年來研究顯示，小鼠在生物醫學科學研究中的作用與大鼠相比更加突出，這種轉變主要是與小鼠模型有一個更大的遺傳工具庫可用有關，特別是基于胚胎干細胞的靶向基因技術。近年來改變大鼠基因組的工具，特別是基因組編輯技術的出現使兩種嚙齒動物之間的技術差距正在縮小。為特定的生物問題選擇正確的模型系統時，大鼠和小鼠之間的生理、解剖、生化和藥理學差異變得越來越重要[17]。

盡管常用的大鼠（Wistar 和Sprague Dawley）和小鼠（C57BL/6 和Balb/c）同屬鼠類，并且具有許多共同特征，但在影響疾病研究模型選擇方面，特別是在神經認知和肌肉運動領域存在差異。比較不同小鼠或大鼠模型的研究發現了兩組在種屬和種群層級中均存在實質性差異，這也表明大鼠和小鼠之間的全部變異程度可能尚未被認識[35]。Ellenbroek B 等[17]的研究顯示，大鼠和小鼠在認知、成癮、沖動和社交行為的基礎研究中表現出截然相反的反應，并且證明了神經變性程度的差異，說明相比小鼠，合理地選擇大鼠模型作為人類疾病的“最佳”模型的重要性。此外，在結合基因敲除技術的急性骨骼肌損傷模型修復過程中，同一種類動物的不同年齡段也表現出差異[36]。

3 總結

建立有效的動物模型是研究骨骼肌損傷問題的首要環節，目前大量的模型建立為骨骼肌損傷的研究奠定了實驗基礎。但在實驗中，動物炎癥反應的啟動、免疫應答的途徑、各種促進修復的細胞群體的募集方式、工作性質與自然生理狀態還存在較大差別，故建立更接近生理狀態的骨骼肌動物損傷模型及符合運動實踐的肌肉損傷模型，對深入骨骼肌損傷的實驗研究具有重要的現實意義。對于以骨骼肌為實驗靶器官的研究應該首選腓腸肌、脛骨前肌；在動物種屬選擇方面，大鼠是實驗動物倫理、實驗技術和實驗物種與人類疾患相近度等方面最合適的備選。而致傷因素的選擇決定于具體實驗的目的，操作的簡便性和標準的統一性最容易接受。因此，在同等條件下，非侵入的實驗模型更有利于實驗的有序進行和實驗數據采集的準確性。