APOBEC3蛋白與HPV及宮頸癌的研究進展

魏 智（綜述） 趙洪波張 濤馮 璇杜 琰△（審校）

（1復旦大學附屬婦產科醫院臨床流行病學研究室 上海200011；2香港中文大學醫學院婦產科系 香港999077）

人載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽3（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 3，APOBEC3）家族的胞苷脫氨酶通過編輯病毒基因組，在病毒感染的先天免疫應答中起著重要作用［1］。然而，APOBEC3（A3）酶的胞苷脫氨酶活性也會誘導宿主基因組中的體細胞突變，這可能會促進癌癥的發生發展。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌的主要病因，但具體作用機制仍有待研究。近期研究發現A3家族可能作為HPV感染至宮頸癌過程中的重要橋梁。本文從A3對HPV及人體內抑癌基因的影響等方面討論目前A3與HPV清除、突變以及宮頸癌發生的研究進展。

HPV與宮頸癌宮頸癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，是全球女性中第四常見的癌癥。全球腫瘤流行病學研究報道，每年約有570 000例新診斷的宮頸癌病例，其中約311 000例因宮頸癌導致死亡［2］。

大量流行病學及分子生物學證據表明，HPV感染與宮頸癌的發生密切相關［3］，尤其是以HPV16及HPV18為主的高危型HPV（high risk human papilloma virus，HR-HPV）［4-5］。HPV致癌機制是病毒整合至宿主基因組。在HPV基因組編碼的8種蛋白質中，非結構蛋白E6和E7與HR-HPV的致癌作用有關。E6和E7蛋白通過干擾有絲分裂過程中的著絲粒復制，直接增加基因組的不穩定性，從而導致染色體重排和拷貝數的變化［6-8］，以及通過降解人體內的p53和Rb抑癌蛋白導致宮頸癌發生［9-11］。同時有研究顯示，HR-HPV持續感染是誘發正常宮頸從癌前病變，即宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）逐步從不同級別（CIN 1級：輕度非典型增生，CIN 2級：中重度非典型增生，CIN 3級：重度非典型增生及原位癌）發展至宮頸癌的關鍵因素［12］。

APOBEC3A3蛋白是一種胞嘧啶核苷酸脫氨酶，其基因定位于22號染色體。目前已發現的A3家族成員有A3A～A3H等7個亞型。A3蛋白是一種重要的免疫分子，很早就有研究發現A3與自身免疫相關［13］。A3G是最早被發現具有抗病毒活性的亞型。在宮頸細胞中A3常被干擾素（interferon，IFN）刺激上調，構成清除外來DNA的重要防御機制。A3蛋白亞型都有1或2個胞嘧啶脫氨酶結構域（cytidine deaminase domains，CD），其一般為His-XGlu-X23-28-Pro-Cys-X2-4-Cys（其中X為任一氨基酸），A3家族抗病毒的胞嘧啶核苷酸脫氨酶活性主要是由CD結構催化完成［13］。CD可以通過作用于單鏈DNA上的胞嘧啶核苷，使其脫氨基生成尿嘧啶核苷，生成的尿嘧啶核苷進而被尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase，UDG）從單鏈和雙鏈DNA中 切 除［14］。脫 嘧 啶 內 切 核 酸 酶（apurinic apyrimidinic endonuclease，APE）進一步促進這種缺失尿嘧啶的DNA降解與清除［15］，至此完成A3蛋白對外源DNA的清除過程。然而，如果單鏈DNA未被UDG和APE處理，僅經A3處理使DNA中胞嘧啶核苷脫氨基為尿嘧啶核苷后繼續被轉錄和復制，轉錄或復制出來的DNA鏈中本身胞嘧啶核苷對應的鳥嘌呤核苷變成腺嘌呤核苷，最終致使形成C→T突變，這可能是DNA或RNA產 生A3特 征 性 突變的重要機制。

有證據表明A3蛋白除抵御病毒感染，在先天免疫系統中發揮作用外，在復制細胞中表達則會導致DNA斷 裂［16］。快 速 復 制 細胞更 易 受 到A3誘導的DNA損傷，支持了A3蛋白導致人類腫瘤基因組不穩定的假設［16］。對癌癥基因表達數據的分析發現，A3B與多個DNA損傷反應和G2/M期細胞周期基因共表達，表明A3B很可能是在G2/M這一活躍復制期引發DNA損傷，并提示A3B可能和細胞DNA的損傷甚至癌癥的發生有密切關系［17］。

APOBEC3與HPV研 究 發 現HPV的DNA中可能存在上述A3特征性突變，在良性疾病及宮頸癌前病變中，A3A、A3C和A3H可能是誘導HPV突變感染的重要亞型［18］。隨后對宮頸角質化細胞W12（該細胞攜帶游離狀態的HPV病毒）的相關研究發現，用IFN誘導內源性A3A、A3F以及A3G過表達，可導致HPV環狀DNA發生突變［18］。宮頸癌和其他HPV相關腫瘤癌細胞中均表現出A3突變特征［19-21］，有研究表明，A3A和A3B是僅有的兩個在HPV陽性角質形成細胞和癌細胞中表達上調的亞型［22-23］，也有研究發現A3G與HPV以及宮頸癌的發展密切相關［24］。

APOBEC3促進HPV的DNA突變有研究通過PCR從CIN和侵襲性宮頸癌（invasive cervical cancer，ICC）患者的宮頸脫落細胞DNA中擴增出16型、52型和58型HPV的DNA，并進行全基因組測 序［25］。總共從151個樣 本中檢測到1 052個核苷酸變異位點，發現主要突變為C→T和C→A。在CIN中主要檢測到C→T突變，但在CIN-2/3級中這種突變較CIN-1級的發生率降低；而在ICC中主要為C→A突變［25］。對其核苷酸序列分析表明，TpCpN是APOBEC的首選靶序列，也是HPV基因組中C→T取代的主要位點［25］。對宮頸角質化W12細胞進行干擾素IFN-β誘導的A3高表達處理后，使用3D-PCR檢測發現A3G可引起HPV16-E2基因的高突變，該突變可能是HPV基因組進化，甚至宮頸癌變的可能原因之一［18］。

目前研究認為人群中流行的HPV16分離株存在高度的遺傳多樣性［26-27］。研究顯示，觀察期間未進展為癌前期或癌癥的HPV感染者中致癌蛋白E7罕見突變的發生率更高，這一發現表明E7在癌前病變或癌癥中更加穩定，不易發生變異，這可能意味著E7的突變可能會降低HPV16的致癌性［26］。最近的一項臨床研究發現了更多的病毒遺傳多樣性，而且其由A3驅動的可能性更大，隊列研究表明這與良性感染或其隨后的病毒清除有關，A3亞型誘導的這一突變可能限制了HPV16的活性，進而限制了HPV16的致癌潛力［28］。因此推測，A3蛋白誘導的這一突變看似有助于促進HPV16譜系的進化，但其實更多的是限制其致癌能力，即起到免疫防御作用。

以上結果提示：A3蛋白是HPV基因組突變的驅動因素，特別是在CIN-1級病變中，較高的HPV病毒復制水平可能使其基因組更容易受到APOBEC的攻擊；HPV基因組在宿主內變異是HPV遺傳多樣性的來源，主要是由宿主細胞A3編輯產生。A3除聯合UDG、APE清除人體細胞感染的HPV DNA外，誘導HPV的SNP變異也可以限制病毒活性，從而降低其致癌能力，起到免疫防御作用。

HPV促進細胞中APOBEC3的表達及活性有研究致力于不同A3亞型（尤其是A3A與A3B）表達上調與HPV感染、癌前病變和宮頸癌的相關性［22］。HPV基因組中常見的C→T突變主要由A3介導，而HPV的DNA復制過程中暴露的單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）是A3的 主 要 目標［20，29-30］。由 此 推 測，HPV的DNA復 制 為APOBEC介導的HPV病毒基因組突變提供了條件。

目前已證明，在HPV陽性的角質形成細胞和宮頸癌組織中，A3A和A3B的mRNA表達通過HPV致癌蛋白E7相關的機制上調，還有研究表明HPV致癌蛋白E6增加了A3B mRNA的表達［22-23，31-32］。其可能機制與p53基因相關，一些實驗提示p53蛋白的失活導致A3B表達上調［32-34］：p53突變后癌細胞中A3B的 表 達 上 調，但 與A3B相 反，野生 型p53可上調A3A的表達［34］；HPV致癌蛋白E6介導的A3B表達上調的可能機制是由于其解除了p53對A3B的表達抑制［32］。由于p53對不同A3亞型表達的調控可能在細胞應激條件下影響病毒感染的過程，了解p53和A3亞型之間的相互作用或許可以為治療持續性病毒感染和腫瘤病變提供新的途徑。除通過p53，HPV還可能通過其他途徑，如cullin 2依賴蛋白、轉錄因子TEAD等，影響A3蛋白的表達，甚至其穩定性［35-36］。

綜上所述，我們認為HPV致癌蛋白E6/E7上調內源性A3蛋白表達水平，為研究HPV陽性癌細胞中A3特征性突變增多提供了新的方向。

APOBEC3與腫瘤理論上，大多數DNA病毒及其宿主的雙鏈基因組應受到保護，不受A3介導的胞苷脫氨作用影響。然而，在雙鏈DNA基因組中經常發現A3誘導的突變。這些A3A和A3B介導的突變主要是由DNA復制過程中滯后鏈模板的脫氨引起的［20］。以上結果說明，癌細胞由于其高水平的細胞增殖和復制壓力，是A3A和A3B介導的胞苷脫氨的主要靶點。

研究發現，A3A有細胞核內編輯HPV DNA的功能，在機體對抗和清除HPV的過程中可能起著重要作用，由此推測A3A可能參與抑制HPV相關腫瘤的發生發展［37］。但也有研究顯示一些腫瘤，如肝細胞癌、乳腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤等中A3特征性突變增加，且A3A可能破壞自身細胞DNA，說明A3可能與腫瘤發生也密切相關［16，38-39］。

通過對19種癌癥的100萬種突變進行分析，發現A3B特征性突變與膀胱癌、宮頸癌、肺鱗癌、肺腺癌、頭頸癌、乳腺癌等至少6種癌癥密切相關［21］。現階段已發現在HPV陽性腫瘤中，A3B過表達及其引起的DNA特征性突變增多［19-21，40］。通過檢測細胞DNA損傷反應（DNA damage response，DDR）通路中經典蛋白激酶的表達情況，發現A3（尤其是A3A）過表達可以激活HPV感染細胞中的DDR通路，從而破壞細胞基因組的穩定性，提示A3A在HPV誘導的腫瘤形成中起重要作用［41］。這些研究表明A3可能成為HPV相關腫瘤治療的新靶點。

APOBEC3與宮頸癌有研究報道轉染A3G的宮頸癌SiHα細胞中HPV E6 mRNA和蛋白表達水平明顯降低、抑癌基因p53mRNA和蛋白表達水平則顯著升高，從而推測A3不僅可以通過清除DNA來抵御HPV感染，還可以通過降低HPV E6和上調p53基因來抑制HPV的致癌作用。另外，在宮頸癌患者A3G基因外顯子3上發現了一個多態性位點（rs5757465），此基因罕見類型（CC型）的比例較高，提示其可能是宮頸病變和宮頸癌的危險因素［42］。

Iizuka等［24］對1～3級CIN及鱗狀細胞癌患者的宮頸活檢組織免疫熒光染色，在CIN及鱗癌病變中均檢出免疫反應性A3G蛋白，其表達強度和陽性面積增加一致，且在CIN-3級病變細胞中明顯高于CIN-1/2級病變細胞。對維吾爾族婦女宮頸癌、CIN及正常對照組織的研究發現，宮頸癌組織中A3G mRNA和蛋白的表達水平均顯著高于CIN組，CIN組又明顯高于正常對照組［42］。提示A3G與癌癥進展存在一定的相關性，其在HPV誘導宮頸癌發生的過程中可能起到重要作用。

APOBEC突變負荷與宮頸癌的突變總數顯著相關性［43］。對69例宮頸癌樣本進行外顯子組測序，發現這些樣本的APOBEC突變模式豐富，主要為TCW和WGA突 變［44］。在HPV感 染 樣 本 中 發 現A3B mRNA在高轉錄水平；與腺癌相比，APOBEC特征突變在具有鱗狀和腺鱗狀組織學特征的宮頸腫瘤中更為常見［44］。

轉錄因子NF-κB在宮頸癌進展過程中具有促腫瘤作用［45］。研究提示經典的NF-κB途徑在不同類型癌細胞的A3B調控轉錄過程中起重要作用［46］。另有研究發現NF-κB活化還可誘導APOBEC蛋白的表達［47］，表明A3是NF-κB通路與宮頸癌的突變特性之間一個重要的聯系紐帶。

研究發現，轉染A3A質粒的宮頸癌Hela細胞遷移數量明顯低于空白質粒轉染組和未轉染組，而后兩者之間Hela細胞遷移能力無明顯差異，提示A3A基因對宮頸癌Hela細胞遷移能力可能具有一定的抑制作用［48］。也有研究發現在用A3G轉染宮頸癌Hela細胞后，A3G過表達抑制了子宮頸癌細胞的增殖和侵襲［49］。這些實驗結果間接提示A3在宮頸癌的發生、發展以及浸潤轉移過程中可能起著重要作用，A3有可能通過抑制宮頸癌細胞的轉移而成為宮頸癌治療的新靶點。

研究發現A3B的上調與癌細胞中異質核糖核蛋白A3（hnRNPA3）水平的增加有關，hnRNPA3通過與單鏈端粒（TTAGGG）重復序列結合并募集端粒酶以延長端粒從而調節端粒長度，而端粒長度是癌癥的一個標志［50］。hnRNPA3還可能與A3B結合并將其募集到基因組DNA中，導致基因組DNA由于A3B脫氨酶活性而發生突變。這兩種機制都可以解釋A3B與癌癥的關聯。此外，免疫熒光分析表明A3B和hnRNPA3是 共 定 位 的［50］。該 研 究 提 示hnRNPA3是一種與A3B相互作用的重要細胞蛋白，可能為潛在的抗癌靶點。

結語本文重點討論目前A3的若干亞型與HPV清除、突變以及宮頸癌發生的研究進展。HPV感染宮頸細胞后，其DNA被A3編輯并清除，從而起到免疫防御的作用。僅被A3編輯而未被成功清除的DNA產生A3特征性突變，其基因組不穩定性增加。HR-HPV致癌蛋白E6和E7在A3的上調中起著很重要的作用，抑癌基因p53是其重要橋梁，其復制過程中產生的單鏈也對A3發揮作用提供了條件；而HPV基因組受APOBEC編輯產生的宿主內變異是HPV遺傳多樣性的進化來源。A3表達水平與宮頸癌細胞中DNA總突變負荷之間存在顯著正相關；在宮頸癌中A3過表達及其引起的DNA特征性突變增多。一些研究表明，A3能抑制宮頸癌細胞遷移能力、促進hnRNPA3表達以延長端粒，在CIN與ICC中表達的強度差異都提示APOBEC蛋白在HPV誘導的宮頸癌發生過程中可能起到重要作用。

作者貢獻聲明魏智資料收集，論文撰寫。趙洪波論文構思和修訂。張濤，馮璇論文修訂。杜琰論文構思、撰寫和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。