靈芝孢子粉和靈芝子實體中麥角硫因的含量測定

付 佳 胡燕燕# 周俊甫 潘新華 康 潔* 陳若蕓*

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050；2.江西仙客來生物有限公司，江西 九江 332000）

麥角硫因（L-ergothioneine，EGT），化學(xué)名為2-巰基-L-組氨酸甲基內(nèi)鹽，是一種天然氨基酸，存在于很多動植物體內(nèi)，但動物機(jī)體自身不能合成，只能從食物中攝取，屬于稀有氨基酸[1]。1909年研究人員首次從麥角的菌核中分離得到該種氨基酸并命名，隨后在動物血液中也發(fā)現(xiàn)其存在，這引起了人們極大的興趣[2]。

自麥角硫因被發(fā)現(xiàn)以來，人們對其性質(zhì)和生物學(xué)功能的研究不斷深入。麥角硫因純品為白色晶體，具有良好的水溶性，室溫下可溶解，在強(qiáng)堿條件下穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，麥角硫因具有顯著的抗氧化活性，機(jī)制主要為：①直接清除活性氧；②螫合各種二價金屬陽離子；③激活抗氧化酶，如谷胱甘肽過氧化物酶和錳超氧化物歧化酶，并抑制超級氧化激酶，如NADPH-細(xì)胞色素C還原酶；④影響各種血紅素蛋白如血紅素和肌紅蛋白[2]等的氧化作用。此外，麥角硫因作為一種天然的生物活性物質(zhì)，還具有調(diào)節(jié)代謝、解毒、維持DNA的生物合成和細(xì)胞的正常生長及細(xì)胞免疫等多種生物學(xué)功能[3]。

李虹奇等[4]1993年首次從赤芝孢子粉中分離得到麥角硫因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，麥角硫因主要存在于真菌、谷類植物體內(nèi)，尤以真菌中存在最為普遍，這一發(fā)現(xiàn)為靈芝孢子粉的質(zhì)量控制提供了新的思路和依據(jù)。本文采用高效液相色譜（HPLC）法測定不同產(chǎn)地的靈芝孢子粉及子實體中的麥角硫因含量，以期為麥角硫因的應(yīng)用和靈芝孢子粉的質(zhì)量控制提供參考。

1 試驗材料

1.1 靈芝孢子粉樣品

破壁孢子粉B-1 產(chǎn)自廣州中山，B-12 產(chǎn)自浙江慶元。未破壁孢子粉B-2、B-3、B-4 產(chǎn)自江西九江，B-7、B-8 產(chǎn)自浙江龍泉，B-9 產(chǎn)自安徽金寨小枝。段木靈芝未破壁孢子粉B-5 產(chǎn)自龍泉。B-6、B-11 為靈芝破壁孢子粉膠囊，產(chǎn)地分別為江蘇南京和福建福州。B-10 為破壁孢子粉壓片，產(chǎn)地為浙江武義。

1.2 靈芝子實體樣品來源

Z-1、Z-2 為北京市售赤芝，Z-3 為福建紫芝，Z-4為長白山鹿角靈芝，Z-5為廣東韶關(guān)草栽靈芝，Z-6為吉林長白山靈芝，Z-7為西藏林芝野生靈芝，Z-8 為江蘇靈芝飲片，Z-9 為西藏林芝白肉靈芝，Z-10 為廣東廣州赤芝，Z-11 為貴州野生靈芝，Z-12為北京赤芝（超聲波粉碎），Z-13 為山東泰安靈芝飲片，Z-14 為吉林段木靈芝，Z-15 為江蘇啟東靈芝。

2 試驗方法

參照文獻(xiàn)[5]的試驗方法，簡便易行。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mg，加入色譜甲醇2 滴，加水至0.5 mL，所得濃度為1 mg/mL，加水稀釋10 倍，得到標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.1 mg/mL。

2.2 供試品溶液的制備

分別稱取靈芝孢子粉樣品各1 g，加入純水10 mL，超聲1 h，溫度60 ℃；分別稱取靈芝子實體樣品各1 g，加入純水15 mL，超聲1 h，溫度60 ℃；取適量上述提取物置于離心管中，以10 000 r/min，離心3 min，取上清液，用微孔水相濾膜過濾即可。

2.3 色譜條件

色譜柱（氨基柱，ZORBAX NH2 250 mm×4.6 mm，5 μm）流動相為乙腈，5 mmoL 醋酸銨水溶液（80∶20），等度洗脫，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃，檢測波長254 nm，得到麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品（A）和靈芝孢子粉（B）的HPLC圖譜（圖1）。

圖1 麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品（A）和靈芝孢子粉（B）的HPLC 圖譜

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按上述色譜條件將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，進(jìn)樣量分別為1、2、4、8、16 μL，測定峰面積，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線。

由圖2可知，麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品在進(jìn)樣量為1～1.6 μg（濃度為0.1 mg/mL）范圍內(nèi)，與峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Y=328.1X-16.20，R2=0.999。

圖2 麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 儀器精密度測定

按上述色譜條件將標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)進(jìn)樣6 次，每次進(jìn)樣量為4 μg，測定色譜峰面積，計算RSD 值。結(jié)果顯示RSD=0.51%，表示在該色譜條件下儀器精密度良好。

2.6 麥角硫因的含量計算

各樣品按2.2 節(jié)方法制備供試品溶液，按2.3節(jié)方法測定各供試品峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算供試品中麥角硫因的含量（10 μg/μL），利用計算公式計算各樣品中麥角硫因的總含量，每個樣品平行試驗3 次，公式：

式中，C為供試樣品中麥角硫因的濃度（mg/mL）；V=10 mL；M為各樣品的質(zhì)量（mg）。

3 樣品測定結(jié)果

3.1 靈芝孢子粉中麥角硫因的含量測定結(jié)果

測定結(jié)果表明，靈芝孢子粉中均含有麥角硫因（表1），其中有9 個樣品的麥角硫因的含量在0.2‰～0.5‰之間，另外3 個樣品的含量在0.04‰～0.08‰。

表1 不同產(chǎn)地不同批次靈芝孢子粉中的麥角硫因含量

3.2 靈芝子實體中麥角硫因的含量測定結(jié)果

采用相同的方法對15 個不同產(chǎn)地和批次的靈芝子實體中的麥角硫因含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示這15 個靈芝子實體樣品中均不含麥角硫因。

4 小結(jié)與討論

本試驗首次采用高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地和批次的12 個靈芝孢子粉樣品及15 個靈芝子實體樣品中麥角硫因的含量，結(jié)果顯示：靈芝孢子粉中麥角硫因的含量有9 個樣品在0.2‰～0.5‰之間，另外3 個樣品在0.04‰～0.08‰之間。所測靈芝子實體均不含有麥角硫因。高效液相色譜法測定靈芝中麥角硫因的含量，具有高效快捷、操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，可有效地測定靈芝中麥角硫因的含量。試驗結(jié)果為靈芝中麥角硫因的含量測定提供了科學(xué)依據(jù)。

麥角硫因是一種稀有的天然氨基酸，具有多種藥理活性，其中以抗氧化活性最為顯著，并且不具有毒副作用，是一種公認(rèn)的較為安全的天然活性物質(zhì)，在醫(yī)藥、保健、食品等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用前景[1]。在檢測中發(fā)現(xiàn)靈芝孢子粉樣品B10、B11、B12 麥角硫因含量比其他樣品低了一個數(shù)量級，原因是這些樣品曾經(jīng)進(jìn)行過水洗，表明麥角硫因水溶性較強(qiáng)，水洗導(dǎo)致流失較多，也提示要注意靈芝孢子粉的水洗問題。

研究發(fā)現(xiàn)，麥角硫因可以由許多微生物如真菌和放線菌自身合成，尤以真菌中存在最為普遍。我國真菌資源豐富，目前國內(nèi)對麥角硫因的研究主要集中在樹舌、樺褐孔菌、平菇和金針菇等上[3,5]，本研究為靈芝中麥角硫因的開發(fā)利用提供了新的方向。