智能手機+顯微鏡原位觀察食用菌菌絲的操作方法

羅友梅 陳瑞雅 李小勇 張銳杰 李思思 李銳新 賀新生

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

食用菌生產者、研究者普遍使用各種生物顯微鏡對食用菌菌絲體、霉菌、細菌等培養物進行觀察，傳統的方法都需要用載玻片制片觀察，無法原位直接觀察試管、培養皿中的培養物，包括：培養物在培養基中的自然生長狀態，如基內菌絲、氣生菌絲、菌絲的自然分枝角度、分生孢子分枝的形態、分生孢子的著生狀態、氣生菌絲老化情況、菌絲的鎖狀聯合、菌核、厚垣孢子等；培養物中的雜菌，如細菌、霉菌黏菌等的污染狀態。而使用帶攝像頭的生物攝影顯微鏡觀察菌絲形態，可以直接獲得圖像，便于學術交流和現場教學、網絡直播交流，但其價格昂貴，使用成本高。

隨著智能手機的攝像功能的日益完善，有研究者嘗試直接用手機鏡頭直接對著顯微鏡的目鏡進行拍攝[1,2]，也有報道運用手機和三腳組合成拍照裝備在顯微鏡下觀察水霧動態視頻的方法[3]。已有手機與生物顯微鏡連接裝置的實用新型專利，如黃馨穎等[4]申請的一種顯微鏡用手機定位拍攝輔助裝置。該裝置結構由目鏡固定架和顯微鏡鏡頭構成，其顯微鏡目鏡用固定架鎖緊調平后使用，解決了顯微鏡拍攝設備造價高、定位不準確、易抖動的問題。陳曉曦[5]發明一種智能手機與顯微鏡頭的可拆式連接座，連接座包括與智能手機背面緊貼的貼合板，以及從貼合板兩端延伸而出并包覆智能手機兩側邊緣的一對夾合板，兩夾合板分別設置有用于彈性夾緊智能手機正面的彈性卡指。沈明學[6]發明一種顯微鏡用手機鏡頭連接器，包括很多個調節座。鄧超[7]提到制作支架用來固定手機，可以觀察多臺顯微鏡下的標本圖像，提高觀察效率，方便師生交流。

本文結合多年的實踐經驗，介紹一種用便攜式支架固定手機，直接在顯微鏡目鏡上照相，原位觀察試管或培養皿中的食用菌菌絲及霉菌、細菌等的操作方法。

1 器 材

智能手機1 臺，手機支架1 個，普通生物顯微鏡1 臺，物鏡放大倍數2×、4×、10×、20×、40×、100×。試管斜面培養物，培養皿培養物。

2 操作方法

2.1 試管及培養皿的放置

如圖1所示，將已培養好的食用菌試管放置在顯微鏡的載物臺上，試管斜面垂直于載物臺，斜面邊緣與物鏡鏡頭中央對齊，觀察培養基邊緣的氣生菌絲；斜面培養基背面朝上，可以觀察培養基內的菌絲。用4×、10×的物鏡直接原位觀察菌絲形態。在不影響觀察的前提下，可用其他物體將試管固定。

圖1 試管斜面培養物的放置

如圖2所示，培養皿背面朝上，放在載物臺上，用4×、10×的物鏡可以觀察培養基內的菌絲體；將培養皿打開，放在載物臺上，用4×、10×、20×、40×、100×的物鏡可以觀察菌絲和細菌的形態。

圖2 培養皿的放置

2.2 構建智能手機和便攜式支架的組合體

把手機固定在支架的卡槽上，有利于在后續的操作中對設備進行微調，同時防止因手的抖動造成手機聚焦困難。首先將支架放于水平桌面上，將智能手機安裝固定于支架上的裝載手機位置，使兩者形成一個組合體。調節手機后置攝像頭與水平面的角度，盡量達到兩者平行。

2.3 顯微鏡的調節

首先調節轉換器，將物鏡轉換成4×物鏡。然后進行對焦，人眼通過目鏡觀察載物臺上的培養物，用右手順時針、逆時針來回轉動粗準焦螺旋，直到視野中出現清晰的圖像，對焦完成。對好焦后即可再次轉動轉換器，調至10×物鏡，此時不再轉動粗準焦螺旋，而是通過調節細準焦螺旋來對焦（方法同粗準的調節一致），從而將物體放大。若調節細準無果，可輕微來回轉動粗準來對其進行對焦。之后用相同的步驟將物鏡依次換至40×、100×，以進一步原位觀察菌絲的形態。由于隨著放大倍數的增大，視野中的光線會變暗，可通過適當調大光圈、調整燈源亮度和聚光器位置等方法加以解決。通過對粗調旋鈕、細調旋鈕及光圈、聚光器等的調整，便可在目鏡內看見清晰的菌絲圖像。

2.4 組合體與顯微鏡結合

將組合體移至顯微鏡的正前方，調節手機支架的高度，使手機的高度高出顯微鏡的目鏡1～2 cm即可。打開手機的照相功能。開始調節手機攝像頭與水平面的角度使手機攝像頭與目鏡平行，同時調節手機攝像頭與目鏡兩者連線的距離，使手機的屏幕中可以看到一個完整且大致清晰的圖像，并盡量調整到可以看見完整圖形的最大值（大致為4 cm）。

2.5 手機對焦以及拍攝

雙手緊貼手機支架的底部，可將其在水平面內前后左右移動，直到手機內可以大致看見菌絲體的形態。在確定好組合體和顯微鏡的距離，以及目鏡和攝像頭的距離后，輕點手機屏幕對其對焦，在可以清晰地看見菌絲體結構后，開始照相。也可在調節好后，再微調細準焦螺旋，使手機內的圖像更為清晰。

2.6 單根菌絲生長動態的拍攝

先把培養皿打開，將培養物放在載物臺上，調節顯微鏡粗、細調節旋鈕，選擇菌落邊緣的單根菌絲放在視野的最邊緣，用透明膠帶固定培養皿在載物臺上的位置。將手機和支架組合體放在目鏡上方合適的位置進行拍照。針對不同生長速度的物種，每間隔1 小時或數小時定時拍照。最后把采集到的圖片用動畫軟件編輯為連續的視頻。

2.7 菌絲中原生質流動的拍攝

把培養皿打開，將培養物直接放在載物臺上。用40×或100×物鏡觀察，選擇單根菌絲進行觀察，如菌絲直徑在5～20 μm 的羊肚菌、雙孢蘑菇、毛霉、根霉等的菌絲，可以用手機拍視頻，觀察菌絲中原生質的流動方向和流動速度。

3 實 例

用上述方法觀察拍攝到的各種食用菌菌絲及霉菌、細菌實例見圖3～5。

圖3 在10×物鏡下原位觀察到的毛霉菌絲和被細菌污染的羊肚菌菌絲

圖4 在100×物鏡下原位觀察到的羊肚菌菌絲與桿狀細菌

圖5 在100×物鏡下原位觀察到的羊肚菌菌絲

4 注意事項

由于目前大部分智能手機的后置攝像頭有2～3 個或以上，在拍照之前應進行初試，找出成像最清楚的那一個再進入后續操作。手機的后置攝像頭應與目鏡靠近但不完全與其接觸，要保持一定距離。在點擊手機屏幕以及拍照時應輕點，否則可能會導致支架劇烈晃動而難以聚焦，也可以選擇質量大的金屬支架予以避免。

原位觀察試管中的菌絲，最好用一個重物放在載物臺外側，擋住試管，以免試管滾落摔破。最好使用15×150（mm）規格的試管，其放在十字推進器上可以左右移動，便于用4×、10×物鏡直接觀察。使用18×180（mm）試管，放在十字推進器上無法聚焦，而直接放在載物臺上觀察，又不便于固定和移動，觀察較困難；使用20×200（mm）的試管也很難直接觀察。使用玻璃、聚丙烯材質的培養皿直接觀察，效果都很好。

在目鏡中放入目鏡測微尺，對培養皿中的單根菌絲進行定位、定時測量，可以測定菌絲的生長速度。

試管、培養皿中的培養基應使用透明度高的培養基配方，最好使用質量較好的瓊脂粉。培養皿中的培養基厚度一般不要超過2 mm。