基于納米材料的電化學免疫傳感器及其在蛋白質檢測中的研究進展

楊倩雯，劉曉風，曾海娟，王金斌

（1.上海市農業科學院生物技術研究所，上海 201106；2.蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

以蛋白質為靶標的檢測技術廣泛應用于疾病診斷、藥物研究、食品及環境中有毒有害物質的分析。蛋白質的常規檢測方法大體分為兩種：一種是依據含氮量推算蛋白含量，如凱氏定氮法、杜馬斯定氮法；另一種是以蛋白質的物理化學性質為基礎，采用相關儀器設備進行檢測，如分光光度法、甲醛滴定法。然而常規檢測技術普遍存在成本高、耗時長、靈敏度低、操作復雜等問題，因此研究者在不斷探索低成本、高靈敏度、操作簡單的新型檢測方法，來彌補常規檢測技術的不足。

目前已有大量研究報道了蛋白質的檢測方法，其中不乏一些操作快速、簡單的檢測方法，如毛細管電泳法、近紅外光譜法、共振瑞利散射光譜法、生物傳感器法等。其中免疫傳感器是目前檢測蛋白質最重要且應用最廣的生物傳感方法。與常規檢測方法相比，免疫傳感器具有靈敏度高、特異性高、耗時短、造價低、易攜帶、操作簡單等多重優點[1]。免疫傳感器通過兩個途徑以提高檢測物質的靈敏性：一是聯合電化學分析技術，如循環伏安法、差分脈沖法、脈沖伏安法等[2]；二是選用良好的電極修飾材料，通過增加峰電流從而提高傳感器的靈敏度。

隨著納米材料在免疫傳感器中的不斷發展，研究者們重點集中于研究納米材料的選擇、復合納米材料的制備以及如何實現新型納米材料的信號放大，納米材料在免疫傳感器的應用為提高其檢測靈敏度帶來很大的突破，并使其具有更廣的應用前景。本文通過總結免疫傳感器構建原理及目前納米材料在免疫傳感器中的應用，匯總免疫傳感器在蛋白檢測中的應用，并對目前免疫傳感器的不足及未來發展方向展開討論，以期為蛋白質的快速檢測提供技術參考。

1 電化學免疫傳感器概述

電化學免疫傳感器是一種連續、可逆的感受生物量和化學量的裝置。電化學免疫傳感器是利用免疫技術結合各種電化學分析方法的免疫分析法，綜合了電化學分析技術的高靈敏性和免疫分析技術的高選擇性和特異性。其原理是將抗原（抗體）固定在基底電極表面，利用抗體-抗原間的相互作用發生免疫反應，使電極及緩沖液的電性發生變化，從而轉變為可檢測信號如電流、電勢及阻抗來確定目標檢測物的濃度[3]，并以此劃分為電流型[4]、阻抗型[5]和電位型[6]免疫傳感器。

1.1 電流型免疫傳感器

電流型免疫傳感器是免疫技術與電化學檢測相結合的標記型免疫分析，它是將生物識別元件通過單一抗體或雙抗體夾心方法的方式發生免疫反應并修飾在傳感器表面，同時清洗去除表面的非特異性吸附，最終通過測定免疫反應引起的電流變化實現對目標的檢測。最早構建的電流型免疫傳感器是用于檢測人絨毛膜促性腺激素[7]。隨著研究的不斷推進，利用電化學方法檢測腫瘤標志物的研究日益增多，電流型免疫傳感器也因此取得很大的進步。至今，電流型免疫傳感器的標記物分為生物酶（如堿性磷酸酶、乳酸脫氧酶、葡萄糖氧化酶、尿素水解酶等）和電活性物質（如二茂鐵、對氨基酚及其衍生物、金屬離子、聚苯胺等）。王曼麗等利用Pt-Pd雙金屬納米材料修飾石墨烯作為載體，固載已標記的抗體分子，構建高特異性、高靈敏的電流型免疫傳感器[8]。Liu Tingzhi等以有機框架材料作為基底，構建了一種超靈敏的夾心式免疫傳感器，用于檢測C反應蛋白[9]。因電流型免疫傳感器具有高選擇性、高靈敏度等優點，現廣泛用于醫學、食品和環境等領域中蛋白質及一些小分子物質的檢測中。

1.2 阻抗型免疫傳感器

阻抗分析方法能夠分析電極表面物質的反應特性[10]，抗原-抗體發生反應后會降低電極表面的電子轉移速率，阻抗增加，可通過測定反應前后的阻抗變化來判斷被檢測物的濃度。阻抗譜包含一段半圓曲線和一段直線，分別出現在高頻區和低頻區，電子轉移速率控制半圓曲線部分，電荷擴散影響直線部分。阻抗型免疫傳感器能夠靈敏地表征電極表面的變化，應用前景廣闊。Cordeiro等研制了首個無標記電化學阻抗免疫傳感器，使用印刷電極檢測嬰兒利什曼原蟲抗體，成功研制出一種靈敏、快速、便捷的免疫傳感器，用于利什曼病的診斷[11]。游凱豪等構建了非標記阻抗型免疫傳感器用于檢測轉基因蛋白Cry1AC，檢測限可達0.8 ng/mL[12]。

1.3 電位型免疫傳感器

電位型免疫傳感器具有高靈敏度、高選擇性，可以直接或間接檢測抗原（抗體），做到實時快速檢測。常用的氣敏電極為CO2、NH3、O2等，離子選擇電極為氟離子電極、三甲基苯胺陽離子電極和電離子電極等。不同蛋白質的等電點不同，在免疫反應發生前后電極表面的極性和密度都會隨之發生變化，最終使得電位發生變化，電位型免疫傳感器便是基于反應前后電位變化進行免疫分析。Silva等以金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）聚合物包合膜實現信號放大，構建了無標記的電位型免疫傳感器用于鼠傷寒沙門氏菌的高靈敏檢測[6]，在此基礎上，Silva等研發了一種新的基于紙張的無標簽電位免疫傳感器用于檢測鼠傷寒沙門氏菌，以紙為基礎的條形電極與濾紙墊集成，設計了一種簡單經濟的方法控制通過聚合物膜的離子通量，通過電化學阻抗譜用來評估修飾步驟及分析檢測結果[13]。

2 納米材料在免疫傳感器中的應用

納米材料具有一系列優異的光學特性，其在免疫傳感器中的應用大大提高了傳感器的性能，功能化的納米復合材料不但能加速信號傳導，同時還能放大識別信號[14-16]。目前免疫傳感器技術已逐步成熟，主要有3 種機制被用來提高免疫傳感器的靈敏度：1）利用新型納米材料的大比表面積和電子轉移能力，盡可能增大修飾電極的比表面積并提高電子轉移率；2）利用生物相容性使納米材料與蛋白相結合，通過作為受體分子和酶標抗體的納米載體來放大免疫反應；3）利用新型納米材料本身特性作為生物探針實現放大信號的作用，例如碳納米材料、有機框架材料、金屬納米粒子及其復合物。圖1為納米材料電化學傳感器構建技術原理。目前，廣泛用于免疫傳感器具有代表性的納米材料有富勒烯（C60）、碳納米管、石墨烯、類石墨烯材料、半導體量子點、金屬有機框架材料（metal-organic frameworks，MOFs）等。隨著研究的不斷推進，越來越多的新材料被用于電化學免疫傳感器的構建中。

圖1 納米材料電化學傳感器構建技術原理Fig. 1 Schematic diagram of the construction of nanomaterial electrochemical sensors

2.1 碳納米材料

2.1.1 富勒烯

富勒烯（C60）是一種碳單質球形納米材料，其高度對稱的結構使其具有獨特的光電性能，生物相容性優異，自被發現以來便受到廣泛關注。在電化學領域，將C60及其復合物用于電化學傳感器的構建，其大比表面積和超導性增強了電信號，大大提高了傳感器的靈敏度，成為目前新型納米材料的研究熱點。Demirbakan等[17]用C60修飾電極，并將抗體通過試劑偶聯在C60層上，采用循環伏安法和電化學阻抗法對過程進行表征并測定熱激蛋白70，所得傳感器的檢測范圍為0.8～12.8 pg/mL。Anusha等[18]通過C60和銅鎳雙金屬納米粒復合修飾電極構建傳感器，用于檢測血液中VD的濃度，實驗結果顯示檢測限為0.002 5 μmol/L。

2.1.2 碳納米管

碳納米管是一種由石墨烯片層卷構形成的一維納米材料，依據結構分為單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳納米管。碳納米管化學性質穩定，具有較大的比表面積、優良的導電性和較好的生物相容性，同時，其獨特的結構使其易于被功能化。功能化的碳納米管在其原有的特性上具有更佳的光電性能，增強了對物質的吸附能力[19]，可連接特定的基團從而對某種物質進行特異性吸附。Gulati等[20]利用垂直排列的多壁碳納米管構建了免疫傳感器用于耐藥白血病細胞的檢測，使用阿霉素對白血病K562細胞進行檢測，檢測限為10 個/mL，該方法具有良好的穩定性、重現性和快速檢測等優點。Rizwan等[21]通過由AuNPs及SWCNTs等組成的復合材料構建了高靈敏的免疫傳感器，用于臨床腫瘤標志物癌胚抗原的檢測。在電化學分析中，碳納米管作為一種電極材料，大大提高了檢測的靈敏度和特異性，成為電化學傳感器研究的熱點。

2.1.3 石墨烯

石墨烯是目前應用十分廣泛的一種二維碳納米材料，具有良好的導電導熱性能，比表面積大。石墨烯獨特的結構使其化學性質穩定且易于功能化。在電化學傳感領域中，石墨烯因其優異的導電性能，大大提高了傳感器的靈敏度，同時，功能化的石墨烯為特異性識別提供了條件。Ren Qunxiang等[22]基于氧化石墨烯和AuNPs修飾電極，構建了一種高靈敏的免疫傳感器，用差分脈沖法在pH 7.4的緩沖液中檢測三聚氰胺，在最優條件下，檢出限達到2.66×10-7μmol/L。Fan Yan等[23]合成氧化石墨烯/硫堇/AuNPs納米復合材料，涂覆于電極表面，用于糖類抗原125抗體固定和檢測信號的放大，檢測限為0.01 U/mL，結果表明，這種免疫傳感器檢測的血清樣品與傳統酶聯免疫吸附試驗檢測的結果一致，相對誤差小于8.05%，且具有良好的重復性、穩定性和準確性。石墨烯由于制備方法簡單、快速、成本低，已經成為構建免疫傳感器的首選納米材料之一。

2.2 類石墨烯材料

類石墨烯材料是一類厚度為幾納米的二維納米材料，其原子的不同排列方式導致了性質的不同，致使它們廣泛應用于諸多領域。類石墨烯材料主要包括氮化硼（BN）、過渡金屬氧化物及過渡金屬硫化物，其中，應用較多的有二硫化鉬（MoS2）、二硫化鎢（WS2）等。

2.2.1 二硫化鉬

MoS2作為一種典型的過渡金屬硫化物，具有獨特的物理和化學性質。納米MoS2性質穩定，具有較大的比表面積，其吸附性能強，在電化學領域具有很大的應用潛力。合成方法的不同，將導致傳感器性能的不同，MoS2的合成分為自上而下法（液相超聲法、鋰離子插層法和微機械剝離法等）和自下而上法（化學氣相沉積法和水熱法）。純MoS2導電性差，常與其他導電材料合成復合納米材料，以增強其導電性[24]。常用于組合的納米材料包括碳納米管、AuNPs及磁性納米粒子等。Zhu Dan等[25]通過MoS2-Ti-AuNPs納米復合材料構建了生物傳感器，用以檢測microRNA-21，AuNPs的加入增強了其導電性。Cao Xiaoyu[26]制備了AuNPs/MoS2/石墨烯納米復合材料，實現了信號放大作用，能高靈敏地檢測DNA。

2.2.2 二硫化鎢

WS2是一種形狀類似三明治的層狀材料，由于原子排列方式和層間堆垛方式的不同，WS2具有不同的結構，有一定還原性。WS2較強的表面效應和較大的比表面積使其廣泛應用于各個領域，是近年來熱門研究的新型納米材料之一。Kong Weisu等[27]以AuNPs/WS2納米棒陣列修飾電極、銀納米粒子/片狀鋅金屬-有機骨架（Ag/ZnMOF）納米酶為載體，構建了一種超靈敏光電生物傳感器，用于檢測博來霉素，檢測限為0.18 nmol/L。Zhang Zhouxiang等[28]基于SWCNTs納米復合二維層狀硫化鎢納米片構建了高靈敏的電化學傳感器，用于檢測VB2，將含有氧化石墨烯的SWCNTs分散液滴涂于電極表面，用WS2改善其結構的致密性和平穩性，成功地應用于VB2藥物樣品的檢測中，檢測限為0.7 nmol/L。

2.3 熒光納米材料

2.3.1 量子點

量子點是近期發現的能夠產生熒光的納米級半導體顆粒。目前研究較多且具有巨大應用前景的量子點為CdX（X＝S、Se、Te）。量子點獨特的光吸收特性，如量子表面效應、尺寸效應、量子隧道效應及介電限域效應等，使其具有穩定性好、熒光壽命長、熒光強度高、可多次激發等優勢。這些優勢成功引起研究者的關注，將其作為熒光標記探針應用于各領域，成為最具潛力和應用價值的新型納米材料。電致發光則是利用量子點優異的光電性能，將光與電化學分析相結合，形成一種十分靈敏的檢測方法。Qiu Youyi等[29]在電極表面加載聚苯胺，以CdS量子點為發光信號源，并利用AuNPs固定MCF-7腫瘤細胞，實現了腫瘤細胞的檢測。Cadkova等[30]將CdSe/ZnS量子點與抗體偶聯構建了一種無酶量子點磁免疫傳感器，實現了對人血清附睪蛋白4的高靈敏檢測，檢測限達到12 pmol/L。

2.3.2 熒光碳點

碳點是一種零維的半導體納米材料，粒徑一般小于10 nm。碳點具有獨特的光學性質，易于功能化，且具有良好的生物相容性、穩定性、低毒性等優點。同時，制備碳點的原料種類豐富、價格低廉，逐步成為研究者的焦點，在傳感器的應用中具有很好的應用前景。基于碳量子電池碳量子點構建的電化學發光傳感器逐步受到關注，其因獨特的光電特性，被用于構建熒光探針應用于各種分析物的高靈敏檢測，包括金屬離子[31]，生物分子[32]及殺菌劑[33]等。隨著對碳點研究的深入，更多的方法被用來提高分析的特異性和靈敏度，比如在碳點表面偶聯具有特異性識別作用的適配體及分子印跡聚合物，而碳點也逐步被廣泛應用于蛋白質的研究中，實現了對特定蛋白的標記和高靈敏分析。

2.3.3 金屬有機框架材料

MOFs是有機配體和金屬離子或團簇發生配位而構建形成的新型多孔材料，結合了無機材料與有機材料的優點。其獨特的結構決定了MOFs具有比表面積大、熱穩定性和化學穩定性良好、孔徑結構可調、吸附性能良好等特性，因而倍受關注。改性MOFs制備出的復合材料可使其更有效地檢測生物分子、陰離子、陽離子、有機化合物等不同物質，因此，MOFs成為構建靈敏傳感器的最佳候選材料[34]。由于MOFs的巨大空體積限制了其導電性，且其中大多屬絕緣材料，選擇合適的材料與MOFs結合修飾，可使MOFs具有獨特的光電特性。MOFs納米復合材料現已被用于多種重要分析物的傳感檢測，用于合成MOFs納米復合材料進行光電電化學檢測的材料主要包括碳基材料、金屬/金屬氧化物納米顆粒、量子點、酶和雜多酸[35]。

Li Jun等[36]用石墨烯制備復合材料檢測對苯二酚和鄰苯二酚等污染物，超聲分散Cu-MOF和氧化石墨烯，并滴于電極表面室溫干燥，結果表明Cu-MOF-氧化石墨烯復合材料在檢測中表現出良好的性能。He Yi等[37]利用AuNPs將MOF-CoFe2O4磁性納米粒子功能化，合成MOFCoFe2O4＠AuNPs夾心型免疫傳感器，用以檢測N端腦前列鈉肽。何曉靜等[38]基于MOFs固載碲化鎘量子點（CdTe quantum dots，CdTe QDs）合成CdTe＠MOFs/CdTe QDs復合物，構建電致發光免疫傳感器，用以檢測心肌肌鈣蛋白I。

除了上述幾種常見納米材料，應用于電化學傳感器研究中的納米粒子還有貴金屬納米粒子（如金、銀、鈀、鉑等）、納米金屬氧化物及納米復合材料。貴金屬納米材料在具有納米材料特性的同時還具有金屬自身的物化性質，成為納米材料研究領域中的熱點，吸引許多學者在其制備、性能及應用方面不斷探索研究并取得一定成果。如銀納米材料能夠快速促進電催化，加速電子轉移速率，實現待測物的靈敏檢測[39]。Wang Zihua等[40]構建了一種以AuNPs、硫堇、羧化多壁碳納米管復合材料為底物的免疫傳感器用于檢測白細胞介素-6。隨著對貴金屬納米粒子研究的深入，一種新型熒光貴金屬納米簇被發現，其具有在可見光到近紅外光區范圍內熒光可調諧的優良光學性質[41]，被廣泛應用于各個領域[42]。

3 電化學免疫傳感器在蛋白質檢測中的應用

隨著研究者的不斷努力，越來越多便捷快速的檢測方法出現并應用于蛋白質的檢測中，如表1所示，每種檢測方法都有一定的缺陷，而與其他檢測方法相比，電化學傳感器攻克了高成本、低靈敏度、易受干擾等問題，廣泛應用于各個領域的蛋白質檢測中。

表1 常用蛋白質檢測方法Table 1 Common protein detection methods

3.1 食品分析

3.1.1 食品過敏原檢測

食品過敏原是能夠引起宿主對食物產生不良反應的一類物質，主要為來源于海鮮、大豆、牛奶、蛋品等食物中的蛋白質[43]。聚合酶鏈式反應和免疫學分析是檢測食物中過敏原的主要方法。隨著檢測技術的不斷發展，傳感技術逐漸應用于食品中過敏原的檢測。Yang Chi等[44]用氧化鋅-量子點復合材料修飾電極構建了伴刀豆蛋白標記的傳感器，用于檢測過敏原雞卵類黏蛋白。Eissa等[45]將石墨烯修飾于電極表面，羧基活化后連接卵白蛋白抗體構建卵白蛋白免疫傳感器，對蛋糕提取物中的卵蛋白進行檢測，此外該作者用同類免疫傳感器對牛奶中的過敏原β-乳球蛋白進行檢測[46]，其檢出限和檢測范圍都達到了令人滿意的結果。Montiel等[47]將磁性微球羧基化后修飾于電極表面并連接花生蛋白Ara h1抗體，然后逐層固定花生蛋白Ara h1、標記抗體和標記辣根過氧化物酶，得到雙重信號放大的免疫傳感器。Kong Weijun等[48]將納米粒子和殼聚糖混合液修飾于電極表面形成氨基薄膜，固載AuNPs得到發光型免疫傳感器，進而得到卵轉鐵蛋白濃度與發光強度的線性關系。

3.1.2 牛奶蛋白檢測

酪蛋白是牛奶營養的主要成分，酪蛋白含量是判斷乳品中是否摻假的重要指標。電化學傳感器在牛奶檢測中的應用克服了傳統檢測方法成本高、耗時長、需專業人員操作等弊端。免疫傳感器的應用能夠有效、高靈敏地檢測牛奶中的酪蛋白。Cao Qian等[49]基于AuNPs/多壁碳納米管構建了免疫傳感器用以檢測酪蛋白，并對AuNPs的吸附時間、電解質pH值和孵育時間進行了優化，最終檢測限達到5×10-8g/mL。

3.1.3 農作物中轉基因蛋白檢測

目前，針對轉基因蛋白的檢測并沒有許多高效靈敏的檢測方法，電化學免疫傳感器在轉基因蛋白檢測中的應用，逐漸成為研究熱點。Zhu Xiaolei等[50]基于量子點構建了熒光酶聯免疫傳感器，用以檢測轉基因MON810玉米的Cry1Ab蛋白。游凱豪等[12]構建了非標記阻抗型電化學免疫傳感器，對轉基因作物及產品中Cry1Ac蛋白含量進行了檢測，最低檢測限達到0.8 ng/mL。Gao Hongfei等[51]將魯米諾作為信號探針構建了電致化學發光免疫傳感器，對轉基因蛋白Cry1Ab進行了定量檢測，且該傳感器成功用于實際轉基因作物的檢測中。由于轉基因作物的種植與安全性受到公眾的高度重視，電化學傳感器檢測轉基因作物的方法仍需更多深入的研究以普及到實際應用中。

3.2 醫療檢測

近年來免疫傳感器用于蛋白檢測的報道不斷涌現，表2對部分用于檢測蛋白質的電化學傳感器進行了總結。

表2 電化學傳感器用于蛋白質檢測Table 2 Electrochemical sensors used for protein detection

在臨床診斷中，許多蛋白被用作一些疾病的識別，通過對高特異性的標記蛋白進行檢測而確診疾病。Tau蛋白是一種微管相關蛋白，聚集于神經性疾病的細胞內。國外對于應用傳感器檢測Tau-381蛋白質的研究也相對較少，Esteves-Villanueva等[56]同樣構建了生物傳感器來檢測折疊的Tau蛋白。Derkus等[57]利用納米免疫傳感器檢測到了0.15 nmol/L Tau蛋白。Dai Yifan等[58]構建了一種一次性的生物傳感器，用于檢測人體血清中的Tau蛋白。Xu Wei等[59]合成了納米盒金屬-有機骨架復合材料，并應用于免疫傳感器中，利用SiO2標記抗lag3抗體，對淋巴細胞活化基因3（lag 3）蛋白進行超敏定量檢測，檢測限為1.1 pg/mL。Gao Ning等[60]通過水熱法合成Zn∶SnO2/SnS2納米復合材料，構建了無標記光電化學免疫傳感器用以檢測β淀粉樣蛋白，Zn的加入顯著提高了電流值，最終檢測限低至0.05 pg/mL（信噪比為3）。

近年來對靶標蛋白質分子的檢測主要依賴于免疫學方法，常規的免疫學方法難以準確檢測低濃度靶標蛋白質，而免疫傳感器的應用彌補了這一缺點。電化學免疫傳感器結合了抗原抗體的特異性反應和新型納米材料的優質特性，能夠做到高選擇性、高靈敏性、快速、簡便地檢測，在蛋白質檢測中具有廣泛的應用前景。

4 結 語

基于納米材料的不斷研究，越來越多的新型材料用于免疫傳感器的構建中，極大地提高了檢測的靈敏度。熒光納米材料以其特有的光學性質廣泛應用于蛋白質的快速檢測中，其中磁性熒光納米材料合成技術成熟但在蛋白質檢測中應用較少，未來仍有巨大的發展空間。更多基于新型有機、無機納米材料構建的免疫傳感器正逐步應用于蛋白質的檢測中，選用合適的修飾材料后，如何用最簡便的方式極大地實現信號放大成為目前研究的一個挑戰，隨著技術的不斷發展，未來在蛋白質檢測領域仍需以下優化：1）提高電極的品質和靈敏度，在此基礎上研究新型傳感器，使其便于攜帶；2）進一步開發導電性強、生物相容性高、環保的新型納米材料；3）進一步優化電化學免疫傳感器的信號放大策略，簡化探針構建過程，實現超靈敏檢測；4）發展微型化的多電極模式，提高檢測通量。