擠壓預處理酶解修飾大豆蛋白乳化特性的研究進展

朱秀清，劉燕清，朱 穎，姜永鵬，劉琳琳

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

大豆不僅是全世界種植范圍最廣、營養價值最高的豆科植物之一，而且是重要的蛋白質來源。大豆中的蛋白質含量比谷類及薯類植物高，為40%左右，且富含人體所需的所有必需氨基酸，其營養和生物學價值可與動物蛋白媲美，可替代動物蛋白質在食品工業中的應用[1-4]。大豆蛋白是由多種L型氨基酸組成的大分子，由于其優異的兩親性和成膜性被廣泛用作食品工業中的乳化劑。蛋白質作為表面活性分子可通過在空氣-水/油-水界面處的吸附、展開和重排來有效地穩定泡沫和乳液[5-7]。乳化特性是大豆蛋白作為食品功能成分的重要功能特性，現代食品加工中需要乳化特性優良的大豆蛋白來發揮乳化劑的作用。與低分子質量乳化劑不同，天然大豆蛋白分子質量大、結構緊密，不能快速移動至界面完成有效吸附，導致乳化特性不夠理想[8]。因此，為了獲得具有更優良乳化特性的大豆蛋白，擴大其在現代食品加工中的應用范圍，需要篩選合適的改性方法。

修飾大豆蛋白功能特性的方法主要有3 種，即物理、化學和酶解改性技術。酶解改性技術由于其反應條件溫和、副反應及其產物少、水解程度易于控制而被廣泛用于改善蛋白質功能[9]。蛋白質水解產物的理化和功能性質主要受水解度和蛋白酶種類的影響。許多研究表明，對球狀蛋白質進行水解可提高其溶解度，暴露分子內部的疏水殘基并減小分子質量，進而改善其乳化特性[10-11]。大豆蛋白中致密的三級和四級結構導致許多酶促位點被包埋，降低了酶解效果，而擠壓預處理可改善蛋白質結構。有研究表明，物料經過擠壓后，其酶促位點數量增加，有利于進行酶解處理，從而提升物料的水解度，導致所得水解產物的理化性質發生顯著變化，說明擠壓是有效促進蛋白水解的預處理方法之一[12-13]。

本文通過闡述擠壓預處理、酶解修飾和擠壓預處理聯合酶解對大豆蛋白乳化特性的影響，為研究擠壓預處理聯合酶促過程改善大豆蛋白乳化特性的機制及生產應用提供理論支撐。

1 大豆蛋白的乳化特性

蛋白質分子的吸收、展開和復位速率會影響其乳化特性，而蛋白質分子內部自由能的減少和膜的流變性會影響乳液的穩定性。大豆蛋白分子中同時含有親水和親油基團，可以降低油相和水相的界面張力并促進乳狀液的形成。形成乳狀液后，乳化的油滴被聚集在其表面的蛋白質所穩定，形成界面膜，該界面膜具有位阻，可有效防止油滴的聚集和絮凝，有利于保持乳液的穩定。因此，大豆蛋白主要是通過降低水和油之間的界面張力來形成乳液，并通過在界面形成物理屏障來穩定乳液，所以大豆蛋白水解物良好的界面成膜性有利于發揮其乳化特性[14-15]。

1.1 影響大豆蛋白乳化特性的因素

1.1.1 內部因素

與其他乳化劑相比，大豆蛋白乳化特性更易受到可溶性蛋白的空間結構、變性程度、溶解性、疏水基團的分布（表面疏水性）和柔性等內部因素影響。

大豆蛋白的空間結構會影響其乳化特性，空間結構松散，隱藏在大豆蛋白分子內部的疏水性基團暴露，可有效提高蛋白在油-水界面和空氣-水界面的吸附能力，從而提高乳化特性；反之，空間結構致密，疏水基團被隱藏在分子內部，導致其乳化特性不理想[16-18]。源博恩[19]發現，改性后的大豆蛋白空間結構發生改變，形成數量更多、體積更小的可溶性聚集體，能有效降低表面張力，從而提高其功能特性。

大豆蛋白的溶解性和表面疏水性是決定乳化活性的主要因素，而分子柔性對乳化穩定性至關重要。關天琪[20]發現，蛋白質乳化特性隨表面疏水性的升高而提高，說明乳化特性取決于蛋白質的油水結合能力，與蛋白質的疏水殘基有關。蛋白質的疏水基團能同時與油和水分子相互作用，從而在乳液形成過程中迅速吸收到油滴表面，達到改善其乳化特性的目的。表面疏水性、柔性分別是影響蛋白質表面活性的靜態因素和動態因素。Zhu Ying等[21]通過研究大豆蛋白的柔性發現，7S球蛋白較11S球蛋白的柔性更好，柔性更好的蛋白質可確保多肽鏈骨架的解折疊，賦予它們出色的乳化特性。

1.1.2 外界環境因素

大豆蛋白的表面活性較好，可有效降低油-水界面的張力，并通過形成界面膜來穩定乳液，但大豆蛋白乳化特性除了受內部因素影響，還受加工方式、pH值、離子濃度、溫度等外界環境因素所影響。

殷軍等[22]發現，在不同加工條件下得到的大豆蛋白乳化特性差異較大，改性后大豆濃縮蛋白（soybean protein concentrate，SPC）和大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）的乳化特性均得到顯著的提高。楊昱等[23]采用極端酸（pH 1～4）和極端堿（pH 10～13）處理SPI，發現極端酸堿處理會提高SPI的溶解性、表面疏水性和乳化特性。極端酸或極堿端處理均會使SPI的天然結構打開，促進蛋白質分子之間的相互作用，進而改善溶解性和乳化特性。孫燕婷等[24]經過研究發現，NaCl溶液會降低SPI溶解性和乳化特性；隨著攪拌時間的延長和溫度的升高，SPI的溶解性和乳化特性均先升高后降低。

1.2 大豆蛋白乳化特性的改性方法

化學改性、物理改性和酶解改性技術是大豆蛋白乳化特性改性的主要方法?？赏ㄟ^不同處理方法來改變蛋白質疏水基團的分布模式，進而改變其空間結構以達到改善大豆蛋白乳化特性的目的。不同處理方法有各自的優缺點，因此，選擇合適的改性方法可以拓寬大豆蛋白乳化特性在食品工業中的應用。

化學改性因其安全性較低已較少使用。酶解改性是通過酶反應達到改變蛋白質分子的大小、空間結構，進而改善其乳化特性的目的。酶解改性的作用條件較為溫和，對大豆蛋白結構的破壞較小，又能起到改善其乳化特性的作用，因此較為常用。物理改性主要是通過擠壓、超聲、超高壓和熱處理改變蛋白質天然結構和分子間聚集方式，達到改善其乳化特性的目的。物理改性具有安全性較好、成本較低、耗時短的優點。不同物理處理方法對SPI柔性和乳化特性產生不同的影響，但處理后SPI的乳化特性均隨柔性的上升而上升[25]。天然大豆蛋白三、四級結構較為復雜緊密，僅用一種改性方法改善乳化性不能達到預期效果，兩種方法綜合使用更能顯著提高乳化特性。

2 擠壓對大豆蛋白乳化特性的影響

2.1 擠壓對大豆蛋白的作用原理

擠壓是常用的物理改性方法之一，擠壓過程中產生的高溫、高壓和高剪切力會破壞大豆蛋白的天然結構，打開分子鏈，導致β-轉角和無規卷曲含量增加，暴露出分子內部的疏水基團，在疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵等非共價鍵的共同作用下形成分子質量較大的蛋白質聚集體，使蛋白質的溶解性降低，進而影響其乳化特性能，其大豆蛋白擠壓機理如圖1所示。Silva等[26]研究發現，在擠壓過程中大豆蛋白游離巰基和總巰基含量增加，而二硫鍵含量下降。Beck等[27]用傅里葉變換紅外光譜儀研究擠壓溫度和轉速對蛋白構象影響發現，擠壓過程β-轉角含量增加，α-螺旋含量下降，但β-折疊（反向折疊）含量沒有顯著變化，因此聚集體的β-結構是維持其構象穩定的重要因素。

圖1 大豆分離蛋白擠壓機理圖[28]Fig. 1 Conformational changes of soy protein isolate after extrusion[28]

2.2 擠壓條件對大豆蛋白乳化特性的影響

擠壓過程中物料水分、擠壓溫度以及螺桿轉速等因素不同會導致蛋白變性程度和聚合程度不同，因此，蛋白擠出物具有不同的理化性質和結構特性，進而對乳化特性產生影響[29]。即蛋白質分子的變性程度與大豆蛋白的乳化特性密切相關，變性的程度由物料水分、擠壓溫度和螺桿轉速等擠壓條件所決定。

物料水分含量的增加，不僅會增強二硫鍵與氫鍵之間的相互作用，而且會增強二硫鍵與疏水相互作用之間的相互作用（P＜0.05）；與此同時還會減少聚集程度以及擠出機內不同區域之間蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質亞基之間的差異，這些結構的變化都對蛋白質的乳化特性起積極作用[30]。即增加水分含量對大豆蛋白乳化特性起積極作用。擠壓過程中化學鍵的變化過程顯示疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵等非共價鍵共同維持擠出物的結構，并且非共價鍵起到維持擠出蛋白空間結構的主要作用。擠出過程蛋白質變性，大豆蛋白形成分子質量較大的蛋白聚集體，從而增加交聯[31]。蛋白質通過機械剪切發生解離/解聚，機械能不斷增加導致蛋白質聚集體解聚的程度增強[32]。在不同溫度和剪切條件下，部分蛋白質發生變性將提高蛋白質的表面活性，表面活性的提高有助于在空氣-水和油-水界面處吸收并形成界面膜，界面膜的形成有助于乳液的穩定。擠壓過程中蛋白質的加熱可能改變蛋白質表面親水和疏水位點的分布模式，使隱藏在折疊結構中的疏水基團暴露出來，從而影響其表面活性和乳化特性[33]。

Mozafarpour等[34]研究發現，擠壓處理降低SPC的溶解性和表面疏水性，與天然SPC相比，擠出的蛋白質α-螺旋結構比例降低，但β-螺旋結構比例增加。SPC擠壓后在均質機內形成水包油乳液的過程中，均質處理施加的機械力會破壞熱誘導聚集體，使其迅速移動至油-水界面上，完成有效吸附，并在液滴周圍形成一層保護層，防止它們在碰撞過程中結合，利于提高大豆蛋白乳化特性[35]。均質化后，擠出的SPC結構中無規卷曲結構的比例顯著增加，SPC的乳化特性得到改善。隨均質壓力不斷升高，剪切作用力增強，蛋白質分子粒徑降低，乳化特性得到改善；當均質壓力大于35 MPa時，蛋白質分子受到的剪切效應和熱效應過強，蛋白質發生不可逆變性，溶解性和表面疏水性降低，導致乳化特性降低[36-38]。還有研究表明，在均質過程中，除機械力外，其均質次數也會影響蛋白質結構和乳化特性。Xu Yeye等[39]研究發現，表面疏水性、柔性和乳化活性均隨均質次數增加（0～3 次）而增加，但繼續均質（3～4 次）其柔性、乳化特性的變化趨勢不明顯，表面疏水性繼續增加。且有研究證明，大豆蛋白的柔性與乳化活性、乳化穩定性呈正相關[40-41]。

綜上，擠壓過程中的剪切效應和熱效應使蛋白質發生不可逆變性，部分蛋白質裂解為多肽和氨基酸，造成分子內部疏水基團暴露，促進蛋白質分子之間的相互作用，利于蛋白酶進行水解作用，進而改善大豆蛋白的乳化特性。

3 酶解對大豆蛋白乳化特性的影響

酶改性技術通常是通過酶解反應對蛋白質分子作用，使大分子酶解成小分子，增加表面電荷、暴露分子內部的疏水基團，進而改變蛋白質的理化和功能特性[42-43]。一定程度的酶解促進蛋白質分子鏈的伸展，使蛋白質分子分解成小分子多肽，同時分子內部疏水基團暴露，促進蛋白質分子之間的相互作用，且隨水解度的增加，大豆蛋白的溶解性和表面疏水性均增加，對蛋白質的乳化特性起積極作用。

3.1 影響酶解反應的因素

酶屬于敏感物質，種類不同，其酶切位點和作用方式不同，對同一底物的水解效率不同。酶切位點的可及性會影響水解過程中肽的大小；酶的種類會影響酶水解產物的理化性質，蛋白質的結構性質和酶的特異性共同作用導致蛋白質功能性質發生改變。影響酶解的因素主要有溫度、時間、pH值、底物濃度、加酶量，其中 pH值、溫度和時間影響最大[44]。有研究報道，在適當溫度下用微生物谷氨酰胺轉氨酶對蠶豆蛋白分離物處理適當時間對蛋白的乳化特性起到積極作用；而處理時間過長和溫度過高，乳液的乳化活性降低，這是由于表面疏水性過度增加，蛋白質加速氧化和液滴聚集[45]。

3.2 酶解改性對大豆蛋白乳化特性的影響

大豆蛋白的酶解改性效果與蛋白酶種類息息相關，選擇合適的蛋白酶對酶解修飾大豆蛋白乳化特性非常重要。黃薇等[46]研究了6 種蛋白酶酶解大豆蛋白的過程變化規律，結果表明，堿性蛋白酶水解大豆蛋白的能力最強，可改善疏水性側鏈基團的分布，利于提高大豆蛋白乳化特性。Alcalase限制性蛋白酶的水解作用有利于保持大豆蛋白的表面活性，對大豆蛋白的乳化特性起積極作用。因此，很多關于大豆蛋白乳化特性的研究都采用Alcalase水解。劉汝萃等[47]利用Alcalase水解SPI，發現SPI的溶解性隨水解度增加而增加，溶解性增加對改善乳化特性起積極作用。已有研究證明，溶解性與乳化活性和乳化穩定性指數均呈顯著正相關，即隨溶解性增加，Alcalase水解SPI產物的乳化特性得到改善[48]。蛋白質溶解性、表面疏水性與其含有的疏水基團和親水基團的比例、分布有關，溶解性增加也可能與小肽的形成有關。

大豆蛋白經過不同酶解時間得到不同水解度的水解物，水解度對大豆蛋白的乳化特性有一定影響[49]。適度水解利于SPI的表面活性改善和乳化特性的提高；而過度水解導致生成的多肽表面活性降低，不利于提高乳化特性。曹承旭等[50]對籽瓜種子進行酶解研究發現，不同酶解時間生成的產物水解度不同，水解度越高，乳化特性越好，且酶解4 h水解度最大，乳化活性最好，而乳化穩定性在酶解2 h 時最好，于愛華等[51]得到了相同的結論。不同水解度的蛋白水解物其功能性質有所不同，輕微水解對乳化穩定性不利，但低水解度大豆蛋白酶解液的乳化活性得到改善。Panizzolo研究發現，大豆分離蛋白酶解結束后降低pH值至2滅酶，得到的大豆分離蛋白水解物（soybean protein isolated hydrolysates，SPIH）比未滅酶處理組表現出更好的乳化特性?？赡苁且驗橥ㄟ^酸處理使剩余的大豆蛋白發生解離和變性，有利于在界面處形成具有良好內聚力和黏彈性的薄膜。而微水解對冷凍停止酶反應的SPIH的乳化特性無益[52]。在不同乳液中，乳狀液的穩定性與液滴粒徑、液滴行為、界面蛋白濃度和界面膜的黏彈性密切相關。

單一酶解有利于改善蛋白質功能特性，但有時單一酶解改性會因為酶切位點被包裹在蛋白質分子內部而達不到預期效果，酶解之前對樣品進行預處理能解決這一問題。李秋慧等[53]通過磷脂輔助酶法對SPI進行改性，發現在一定酶解時間內，磷脂酶解產物可通過促進乳化體系在水-油界面上形成穩定的界面膜提高乳液的穩定性。除此之外，李慧娜[54]通過超聲波輔助酶解SPC，并對其乳液穩定性的影響進行研究，發現超聲預處理后的SPC酶敏感性增強，乳化能力得到改善，效果較單獨酶解或單獨超聲改性都好。?；勖舻萚55]也采用超聲波輔助酶解研究米糠蛋白的表面活性，發現超聲波輔助酶解有利于改善米糠蛋白的溶解性和乳化活性，不利于提高乳化穩定性。物理改性和酶解法聯合，除采用超聲波輔助酶解外，也有關于擠壓聯合酶解修飾大豆蛋白乳化特性的研究，但現有報道較少。

4 擠壓-酶解對大豆蛋白乳化特性的影響

天然大豆蛋白的三級結構非常緊密，蛋白質肽鏈上的肽鍵不易被水解，但經過擠壓處理后，大豆蛋白分子被打開，暴露出更多隱藏在蛋白質內部的酶切位點，有利于水解，使得溶解性增加，進而改善其乳化特性。即擠壓-酶解聯合處理對大豆蛋白乳化特性起積極作用，其機理如圖2所示。

圖2 擠壓-酶解大豆蛋白的乳化機理圖[56]Fig. 2 Changes in emulsifying properties of soy protein isolate after extrusion-enzymatic treatment[56]

Clemente[57]發現酶解可以增強或降低大豆蛋白的功能特性和營養價值。Lamsal等[58]評價了酶解擠壓大豆粉的功能特性，并證明了擠壓過程影響大豆蛋白的功能和感官特性。Surówka等[59]發現大豆蛋白經擠壓預處理后，其所有亞基都能被酶快速降解。擠壓預處理與酶解修飾對大豆蛋白乳化特性及其他特性有協同增效作用，且無副作用。李楊等[60]采用擠壓-酶解修飾SPI乳化特性，發現擠壓預處理使大豆蛋白分子結構打開，暴露出更多的酶切位點，可促進SPI水解，有利于提高其水解度、溶解性和表面疏水性，進而達到改善大豆蛋白乳化特性的目的。Chen Lin等[61]的研究證實了擠壓預處理會使大豆蛋白的天然結構破壞，進而暴露出更多酶切位點，有利于蛋白酶水解，從而改善其乳化特性。在酸性條件下，大豆蛋白乳化特性會有所下降，為提高酸性條件下的乳化特性，趙彩紅等[62]采用擠壓膨化與菠蘿蛋白酶復合方法改性SPI，使得SPI乳化特性得到顯著提高。綜合目前擠壓-酶解改善大豆蛋白水解產物功能性質的研究結果，擠壓預處理協同酶解對蛋白的吸水性、溶解性均有促進作用，進而改善其乳化特性[63]。蛋白質良好的溶解性可促進其在水包油乳液界面遷移，包裹油滴形成物理界面層，與此同時表面電荷產生排斥力阻止聚集，有利于維持乳液的穩定狀態。良好的溶解性是蛋白質形成穩定乳液體系的先天條件，當溶解性改善，乳化特性也得到一定程度的改善。蛋白質的表面疏水性可以反映蛋白質分子的聚集趨勢和表面疏水基團的數量。親水和疏水基團的平衡有利于提高大豆蛋白乳化特性，親水性過強，顆粒吸附到油滴表面的能力減弱，會發生破乳現象；疏水性過強則會降低水溶性和表面活性[64]。Ma Wenjun等[65]以大豆蛋白為原料，采用擠壓聯合酶解的方式，考察大豆蛋白構象和功能變化。采用3 種擠壓溫度（60、80 ℃和100 ℃）預處理后進行酶解，發現擠壓酶解處理顯著改變了大豆蛋白的空間結構和功能特性，如二硫鍵數量急劇增加，巰基數量減少，并且隨著擠壓溫度升高和水解時間的延長，大豆蛋白的持水性和溶解度增加。擠壓處理有利于提高蛋白質的乳化活性，但會降低蛋白質的乳化穩定性。因此，大豆蛋白通過擠壓預處理，不僅在擠壓套筒內促進了蛋白-脂質復合體形成，同時更有利于蛋白酶對蛋白質擠出物進行水解，從而使其乳化特性得到明顯改善。

綜上所述，擠壓預處理聯合酶解改性改變了疏水基團的分布模式，顯著改善大豆蛋白的乳化特性。擠壓聯合酶解方法是一種高效的球狀蛋白功能修飾方法。

5 結 語

天然大豆蛋白結構較為復雜，大部分疏水基團被隱藏在分子內部，肽鏈折疊盤旋，形成致密球狀結構，不利于酶解。對大豆蛋白進行預處理，可破壞其天然結構，暴露出更多的酶切位點，從而有利于酶解。擠壓處理是一種高效的預處理方法，經過擠壓預處理后的SPI分子鏈打開，暴露出被隱藏的酶切位點，利于酶解的進行，進而改善其乳化特性。因此，擠壓聯合酶解法是一種高效的球蛋白改性方法。大豆蛋白擠壓預處理酶解修飾大豆蛋白乳化特性的研究有助于拓寬擠壓輔助酶解處理在大豆蛋白相關食品體系中的應用領域。但目前此類研究還較少，其作用機理還有待進行更深入的研究。相信在不遠的將來，隨著新工藝技術的發展，必將大力推動擠壓輔助酶解改性大豆蛋白在工業上的發展與應用。