冰片增強依達拉奉對腦缺血再灌注損傷大鼠抗氧化作用研究

王文生·王月，陳 悅，賈紅娥，郭冬梅

（1.烏魯木齊市中醫院南門醫院心腦病科，烏魯木齊 830000；2.新疆醫科大學附屬中醫醫院老年病科，烏魯木齊 830001）

缺血性腦卒中（ischemia stroke，IS）是臨床常見的腦血管系統疾病[1]。目前常以溶栓聯合神經保護藥物治療，但溶栓可能會導致失語、半身不遂[2]。依達拉奉（edaravone）是一種氧自由基清除劑，在缺血性腦卒中治療中應用廣泛[3]。部分患者使用依達拉奉后仍存在神經功能損傷[4]。中醫理論中腦缺血病機為“血行緩慢致瘀，瘀邪化熱致毒，毒邪傾體以致腦神逆亂”。因此，缺血性腦卒中早期治療應“芳香開竅，祛瘀散熱”“祛除邪毒”[5]。且中西醫聯合是提高缺血性腦卒中患者治愈率的有效途徑。冰片（borneol）為龍腦香科植物龍腦，多用于中風、痰熱、神昏竅閉等證，具有“引藥上行”“芳香走竄”的功效，常作為輔藥以促進藥物吸收[6]。因此，冰片聯合依達拉奉治療能夠提高其抗氧化效果。本研究通過構建腦缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）模型，探討冰片聯合依達拉奉對I/R 的影響，為冰片配伍依達拉奉用于治療缺血性腦卒中提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 冰片（艾片，borneol，左旋龍腦，含量≥86.0%，湖北俊輝藥業有限公司）；依達拉奉注射液（必存，江蘇先聲東元制藥有限公司，批號：80190401）；L3200 大鼠線栓（200～240 g，廣州佳靈生物技術公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，北京索萊寶公司）。MDA（malondialdehyde，丙二醛）試劑盒、SOD（superoxide dismutase，超氧歧化酶）試劑盒與GSH（glutathione，谷胱甘肽）試劑盒（上海酶聯生物技術公司）；Anti-ZO-1（閉鎖小帶蛋白1）、Anti-Occludin（咬合蛋白）、Anti-Claudin-5（閉合蛋白5）、Anti-β-actin（β-肌動蛋白）抗體（北京博奧森生物技術公司）。

1.2 動物分組與給藥 60 只SD 大鼠，由新疆醫科大學動物實驗中心提供，清潔級，雄性，7～8 周齡，體質量230～250 g，標準飼養環境。大鼠隨機分為假手術組，腦缺血再灌注組，腦缺血再灌注加依達拉奉組，腦缺血再灌注加冰片組，腦缺血再灌注加依達拉奉加冰片組，每組12 只。腦缺血再灌注模型構建前3 天與構建后2 h，腦缺血再灌注加依達拉奉組與腦缺血再灌注加依達拉奉加冰片組尾靜脈給藥4 mL·kg-1依達拉奉，腦缺血再灌注加冰片組與腦缺血再灌注加依達拉奉加冰片組灌胃給藥15 mL·kg-1冰片溶劑。

1.3 I/R 模型構建與神經功能評估 麻醉大鼠，自頸部開口，分離出頸外動脈與頸內動脈，將線栓插入頸總動脈，前進至頸內動脈約16～18 mm，固定線栓，縫合傷口。線栓插入2 h 后，取出線栓并結扎頸總動脈。假手術組僅麻醉后游離出頸總動脈。拔出線栓24 h 后，對各組大鼠神經功能評估。評分標準：0 分，行為正常；1 分，缺血對側前肢無法伸展；2 分，缺血對側前肢無法伸展，僅能向一側轉圈；3 分，向一側轉圈時側推易跌倒；4 分，癱瘓。

1.4 腦梗死評估 取大鼠分離出全腦組織并冷凍成塊，切成5 片約2 mm 厚切片，浸沒于2 % TTC 溶劑中，避光孵育30 min，37 ℃。4% 多聚甲醛固定，按順序排列后拍照分析。

1.5 腦水腫評估 取大鼠全腦組織，電子秤稱重，記為濕重。干燥去濕，6 h 后稱重，記為干重。腦水腫程度=[（濕重-干重）/濕重]×100 %。

1.6 血腦屏障完整性評估 取大鼠，皮下注射4 mL/kg伊文思藍溶液。2 h 后處死，取缺血側腦組織，加入2 mL 甲酰胺勻漿，離心（12 000 r·min-1，20 min），取上清液。在620 nm 波長下檢測各個樣品孔OD值，根據標準曲線，計算出各組樣品蛋白含量。

1.7 氧化因子、炎性細胞因子檢測 取大鼠缺血側組織，加入PBS混合勻漿。12 000 r·min-1離心后取上清液，用于氧化因子或炎性細胞因子的檢測。具體檢測流程根據試劑盒說明書步驟開展。

1.8 血腦屏障相關蛋白檢測 取大鼠缺血側基底層組織，加入裂解液勻漿，離心取上清液，加入上樣緩沖液，沸水浴變性。開展Western blot，并濕法轉移凝膠上蛋白至PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉。使用一抗稀釋液浸沒PVDF 條帶孵育過夜，再以二抗稀釋液孵育。顯影儀下顯影獲得蛋白條帶，以β-actin 作為內參，計算目的蛋白相對表達量。

1.9 統計學分析 實驗數據采用SPSS 22.0 軟件進行分析。實驗結果用均數±標準差（）表示，各組數據之間采用單因素方差分析（One way Anova），各組數據兩兩比較采用Tukey檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較 見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分比較（，n =12） 分

表1 各組大鼠神經功能評分比較（，n =12） 分

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與腦缺血再灌注組比較，△P ＜0.05

2.2 各組大鼠腦梗死體積占比比較 假手術組染色顯示為紅色，即無任何梗死區域；腦缺血再灌注組中缺血側組織染色幾乎全部為白色。見表2，圖1。

表2 各組大鼠腦梗死體積占比比較（，n =12）

表2 各組大鼠腦梗死體積占比比較（，n =12）

注：與腦缺血再灌注組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

圖1 各組大鼠腦梗死區域染色

2.3 各組大鼠腦水腫程度比較 見表3。

表3 各組大鼠腦水腫程度比較（，n =12）

表3 各組大鼠腦水腫程度比較（，n =12）

注：與假手術組比較，## P ＜0.01；與腦缺血再灌注組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

2.4 各組大鼠腦中氧化因子與抗氧化因子水平比較 見表4。

表4 各組大鼠腦中氧化因子與抗氧化因子水平比較（，n =12）

表4 各組大鼠腦中氧化因子與抗氧化因子水平比較（，n =12）

注：與假手術組比較，## P ＜0.01；與腦缺血再灌注組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

2.5 各組大鼠腦中炎性細胞因子水平比較 見表5。

表5 各組大鼠腦中炎性細胞因子水平比較（，n =12）

表5 各組大鼠腦中炎性細胞因子水平比較（，n =12）

注：與假手術組比較，## P ＜0.01；與腦缺血再灌注組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

2.6 各組大鼠腦組織中緊密連接蛋白表達與量化統計比較 見圖3。與假手術組相比，腦缺血再灌注組中ZO-1、Occludin 與Claudin-5 表達水平明顯降低（P＜0.01）。與腦缺血再灌注組相比，腦缺血再灌注加依達拉奉組與腦缺血再灌注加冰片組ZO-1、Occludin 與Claudin-5 表達增加（P＜0.05）。腦缺血再灌注加依達拉奉加冰片組ZO-1、Occludin與Claudin-5表達水平增加更明顯（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠腦組織中緊密連接蛋白表達與量化統計比較

3 討論

目前，靜脈溶栓與神經保護藥物聯合使用是缺血性腦卒中主要治療方式[7]，可幫助患者血流再通，但部分患者也會出現再灌注損傷[8]。本研究通過線栓法構建大鼠腦缺血再灌注模型。結果顯示，腦缺血再灌注造成大鼠神經功能異常，腦組織中出現梗死區域。與此同時，構建模型的各組大鼠出現不同程度的水腫，以腦缺血再灌注組最為明顯。此外，腦缺血再灌注導致大鼠腦組織中氧化因子、炎性細胞因子水平增加，抗氧化因子水平降低。以上結果提示本研究中腦缺血再灌注模型構建成功。

中醫認為，缺血性腦卒中屬于“血瘀證”，其特點為阻血滯氣、傷神損絡，治療原則為活血化瘀，若清竅阻滯，則氣血失于上行，水津失于輸布，痰瘀邪毒蘊結。現代醫學認為，大腦具有高能耗的特性，對缺血缺氧更敏感[9]。腦缺血再灌注會介導細胞膜中不飽和脂肪酸形成脂質過氧化物[10]。如MDA 屬于氧化應激最終產物，會造成蛋白質、核酸等大分子的交聯聚合，產生細胞毒性，與中醫理論中的邪毒一致。SOD 與GSH 是機體內清除氧自由基兩種主要活性成分，組織內MDA、GSH 水平與SOD 活性可反映氧自由基損傷程度[11]。在氧化因子的攻擊下，血腦屏障內皮細胞會出現不同程度損傷，細胞間緊密連接結構出現不同程度破壞，以緊密連接中ZO-1 蛋白、跨膜蛋白中Occludin 蛋白、Claudin 蛋白表達降低為特征[12]。在內皮細胞損傷情況下，微血管與腦實質器官會出現損傷，血腦屏障的開放程度增加，外周水分子進入造成腦水腫[13]。中樞炎性細胞因子在應激條件下的過度釋放進一步加大血腦屏障開放程度，造成神經元壞死，出現局部的梗死區域[14]。生理條件下，體內會通過抗氧化應激系統清除多余的活性氧，避免MDA過量產生。但腦缺血再灌注過程中，機體內抗氧化系統功能無法完全抵御氧化應激的過度激活，因此需要外源性藥物輔助治療。

依達拉奉是一種氧自由基清除劑，研究顯示依達拉奉基于Nrf2/HO-1 信號通路，誘導Akt 的激活，發揮抗氧化抗炎作用[15]。本研究中，依達拉奉降低了氧化因子MDA 水平，增加了抗氧化因子SOD 與GSH水平，降低了炎性細胞因子水平。然而，在大鼠腦組織梗死體積、腦缺血和神經功能的宏觀指標中，依達拉奉無法完全逆轉腦缺血再灌注造成的損傷。因此，腦缺血再灌注治療需要聯合給藥促進依達拉奉發揮抗氧化功能。

中醫常用配伍藥物為冰片，具有“獨行則勢弱，佐使則有功”的特性。現代醫學研究發現，冰片不僅能穿過血腦屏障，而且能改變血腦屏障通透性，促進其他藥物透過血腦屏障。本研究中，冰片介導了腦組織中炎性細胞因子部分降低，對氧化應激因子具有一定抑制作用，但作用不明顯。在依達拉奉配伍冰片的應用中，腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應激因子、炎性細胞因子水平明顯降低，抗氧化應激因子明顯提高。在大鼠宏觀指標中，與腦缺血再灌注組相比明顯改善。

綜上所述，冰片具有“通諸竅、散郁火”功能，用于腦缺血治療具有部分療效。冰片增強了依達拉奉抗氧化作用，提高了神經保護作用。這種配伍方式符合“相須相使”的配伍原則，值得在溶栓后抗腦缺血再灌注損傷治療中應用。