豬精子冷凍損傷與保護(hù)劑的研究進(jìn)展

張 群，王 騫，郭銘暉，王 碩，魏華凱，李雁冰，黃大鵬，魏國生，李井春

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

自2009年起，在國家的大力扶持下，全國范圍內(nèi)建立了多家規(guī)模較大、實(shí)力較強(qiáng)的公豬站。人工授精技術(shù)的普及使全國各地建設(shè)成一個完備的種畜精液供應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，優(yōu)秀的種畜得到充分利用，加快了養(yǎng)豬行業(yè)品種改良進(jìn)程。此項(xiàng)技術(shù)操作簡單、生產(chǎn)成本低并且安全高效。在常溫環(huán)境下精子在長時間、長距離的運(yùn)輸中，保存時間很短，需采用低溫冷凍保存技術(shù)。現(xiàn)如今牛精液的冷凍保存技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但不同物種的精子對溫度的敏感程度不同。豬精子在冷凍保存過程中十分容易受損傷，導(dǎo)致精液品質(zhì)下降。如何在低溫保存過程中既最大限度地保留種畜遺傳材料，又不會對精子質(zhì)量造成損傷，在精液在交流過程中有效保證生物安全，是科技工作者們研究和討論的重點(diǎn)及難點(diǎn)。

1 豬精液冷凍保存技術(shù)發(fā)展史

早在1949年，Polge[1]等在實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)在稀釋液中添加一定量的甘油能使經(jīng)過短暫冷凍后的精子完全恢復(fù)活力，精子成為第一個成功冷凍保存的哺乳動物細(xì)胞，這為之后的各種器官、組織、細(xì)胞等低溫冷凍研究提供了依據(jù)，特別是使人們開始了對低溫情況下細(xì)胞受損或死亡原因的研究。隨后Polge等在對不同種類哺乳動物精液進(jìn)行冷凍保存研究時發(fā)現(xiàn)，動物種類不同，適宜的甘油濃度也不同，豬精子適宜的濃度為7.5%。此后，美國、法國、澳大利亞、德國等[2]相繼報道使用豬冷凍精液成功受精產(chǎn)下仔豬。

中國對豬精液冷凍保存的研究起步較晚。1973年，廣東、廣西等地開始引入精液冷凍技術(shù)，并且迅速進(jìn)入快速發(fā)展階段。1977年全國豬精液冷凍技術(shù)研究協(xié)作組成立，對精液冷凍問題開展深入研究并規(guī)范操作[3]。近年來，我國在精液稀釋液、冷凍保護(hù)劑和冷凍程序方法等方面已經(jīng)取得一定成績，但在損傷機(jī)理方面尚沒有完全清楚，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究探索。

2 精子受冷凍損傷機(jī)制

2.1 物理損傷

精液冷凍過程中，物理損傷主要來自溫度急劇下降，液體結(jié)成冰晶，對細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)部造成損傷。若能減少大冰晶的產(chǎn)生就能盡可能地降低精子受損程度[4]。這種機(jī)械損傷主要受冷凍溫度下降速度和速率的影響。因此，在凍精生產(chǎn)制作過程中，溫度平衡要處于一個合理范圍內(nèi)[5]。

2.2 化學(xué)損傷

在精子內(nèi)部，復(fù)雜的氧化還原體系維持著精子細(xì)胞內(nèi)部各物質(zhì)之間的相互作用。冷凍保存操作過程中，精子所處內(nèi)環(huán)境發(fā)生巨大變化，活性氧（ROS）在體內(nèi)是不可或缺的，是精子細(xì)胞正常生理代謝的產(chǎn)物，主要在細(xì)胞信號、線粒體功能和免疫等過程中發(fā)揮作用。但由于精子是高度分化的細(xì)胞，沒有攜帶抗氧化物質(zhì)的能力。在冷凍過程中，最容易受到損傷的就是精子質(zhì)膜，并且精子膜的完整程度也直接影響精子受精能力[6]。在體外環(huán)境中，氧化還原平衡被打破，大量的ROS無法被反應(yīng)中和，很容易與精子細(xì)胞膜上的磷脂發(fā)生氧化反應(yīng)，破壞其結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能發(fā)生改變，從而導(dǎo)致精子的受精能力下降。此外ROS還會抑制酶類的活性[7]，導(dǎo)致其失活。不能盡快清除ROS，氧化損傷會造成精子運(yùn)動性和受精能力受損，甚至破壞細(xì)胞核中的DNA[8]。

3 豬凍精保護(hù)劑研究與運(yùn)用

3.1 糖類

3.1.1 紅景天多糖

紅景天多糖由中草藥中提出，具有很強(qiáng)的抗氧化、抗衰老和抗細(xì)胞凋亡等作用。研究表明，紅景天多糖可以清除超氧自由基，并且能有效地抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[9]。張樹山等[10]實(shí)驗(yàn)表明，在豬精液冷凍過程中，添加紅景天多糖凍后精子活力與活性有增強(qiáng)，最適宜量為6 mg/L，但用量過多有負(fù)面影響。添加紅景天多糖后并且線粒體活性、頂體完整率、質(zhì)膜完整率等多項(xiàng)指標(biāo)都有明顯改善。任子利[11]在藏豬精液冷凍保存實(shí)驗(yàn)中顯示，在冷凍精液中添加紅景天多糖不僅可以改善精液品質(zhì)，同時可明顯降低DNA甲基化的影響。

3.1.2 黃芪多糖

黃芪多糖是中藥黃芪中的主要成分，抗氧化活性很好，在動物體內(nèi)沒有殘留問題，且不會產(chǎn)生耐藥性[12]。宋健等[13]在豬精液解凍復(fù)蘇液中加入黃芪多糖，結(jié)果表明加入藥品的實(shí)驗(yàn)組線粒體活性明顯增加，對精子的穿卵率受精效果也有提升。李珣等[14]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，精液冷凍前后，由于氧化反應(yīng)破壞，過氧化酶活性以及mRNA表達(dá)均下降。添加黃芪多糖后，過氧化酶活性提高，精子抗氧化能力增強(qiáng)。

3.2 大豆卵磷脂

冷凍過程中，卵黃是保護(hù)精子免受低溫打擊的有效成分，在生產(chǎn)實(shí)踐中也取得了很好的效果[15]。但由于動物源成分十分復(fù)雜，其安全性也一直被質(zhì)疑。并且卵黃會與精子中一種蛋白凝固酶發(fā)生反應(yīng)，對精子生存有不利影響。大豆卵磷脂是一種適合替代卵黃的植物性產(chǎn)品，普遍存在于哺乳動物的生物膜中[16]，可用于維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。汪俊躍[17]用大豆卵磷脂代替卵黃在豬精液冷凍保存效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加5%高壓均質(zhì)大豆卵磷脂可以替代卵黃在冷凍精液保存中的作用。

3.3 咖啡因

咖啡因是從咖啡、茶葉中提取出來的一種生物堿，在生物體中有提神，興奮的作用。早在1978年就有咖啡因用于人類人工授精的實(shí)驗(yàn)[18]，同時對少精癥患者精子活率有提高效果。郭雅欣[19]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，冷凍過程中在4 ℃降溫平衡過程中加0.2 g/L咖啡因，解凍后精子在體外存活時間明顯增長，活力和活率均有顯著改善。谷合勇[20]實(shí)驗(yàn)也有相似結(jié)果，咖啡因可以增加精子細(xì)胞對葡萄糖的氧化能力，為精子提供更多能量，加快精子的運(yùn)動能力。

4 小結(jié)與展望

豬精液冷凍技術(shù)實(shí)現(xiàn)了優(yōu)良種畜精液長距離運(yùn)輸，不僅降低了成本，更是對品種改良增加動力，在疾病防治等方面也有重要意義。近幾年，我國精液冷凍行業(yè)飛速發(fā)展，但仍存在很多問題。如何提高解凍后精子活力和活率和解決精子在冷凍過程中受到的氧化損傷，都是值得深入研究的難點(diǎn)。