液體活檢技術在腫瘤診斷領域的應用

宋桂鋒，楊海瑩

（河北省張家口市萬全區中醫院普通內科，河北 張家口 076250）

癌癥（cancer）一直是世界人民最關注的健康議題之一，其高發病率和高死亡率使得人們談癌色變。據最新的全球癌癥數據統計顯示，人類癌癥發病率約為21.4%，死亡率約為17.7%，男性癌癥的發病率比女性高出20%，即1/5 的男性和1/6 的女性可能患癌，而1/8 的男性和1/10 的女性將死于癌癥[1]。癌癥已成為全球疾病死亡的主要原因，而基因突變是導致腫瘤產生和發展的重要因素，幾乎所有腫瘤都有DNA 突變，這些突變的存在使得腫瘤細胞不同于正常細胞，因此也成為腫瘤細胞檢測和追蹤的特異性生物標志物。現階段研究表明，腫瘤中DNA 突變位點和基因種類繁多，且不同腫瘤具有不同的特異性，這也為腫瘤的精確診療提供了可能性[2-4]。如何有效利用這些特異性的生物標志物來進行精確診療，這就對精準檢測技術提出了更高的要求。

近年來，液體活檢技術在腫瘤診斷領域成為研究熱點，作為體外檢驗的一個分支，它可以利用人血液、尿液、淋巴液、唾液、腦脊液、唾液、胸腔積液等多種液體樣本進行疾病的分子鑒定與檢測。其僅需取少量體液，即可通過DNA 測序等手段獲得一張更完備的全身癌癥的分子圖譜，這對于精準醫療來說是一項突破性的技術。相較于傳統的組織活檢，液體活檢技術具有連續監測、多個腫瘤同時監測、可重復性、非侵入性等優勢，有助于指導腫瘤的早期診斷、疾病監測、個性化治療、精準靶向用藥、準確預后、預測復發等[5-7]。研究認為，使用體液中的生物標記物進行腫瘤分析將開始改變癌癥的診斷，液體活檢成為標準的臨床工具將具有相當大的臨床意義[8]。體液中含有癌癥來源的成分，可作為研究對象，實現腫瘤的分子鑒定。基于此，本文就液體活檢技術在腫瘤診斷領域中的研究進展作一綜述，進一步闡明并歸納其在腫瘤早期診斷及預后判斷中的作用，并對該領域的發展趨勢進行展望，以期為相關科學研究和臨床診療提供思路。

1 液體活檢對象

1.1 循環腫瘤細胞 循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是指從腫瘤原發灶和（或）轉移灶脫落，游離在外周血液循環系統中的腫瘤細胞。Récamier于1829 年首次報道了腫瘤細胞從腫瘤組織脫落的這一現象，而后有學者提出這些脫落的腫瘤細胞可以穿過正常組織，進入到循環系統造成早期轉移[9]。隨著檢測技術的不斷提升，CTCs 的分離和檢測得以實現，并首次經FDA 認證應用于臨床診斷[10]。CTCs作為完整的腫瘤細胞，攜帶了包括基因組和蛋白組等大量信息。對CTCs 分離進行體外培養，可通過顯微鏡直接觀測其形態進而判斷腫瘤的惡性表型，亦可構建永久細胞株，進行各種體內外功能實驗。通過免疫細胞化學實驗、熒光原位雜交、單細胞基因組測序等，可鑒定CTC 表型，檢測基因突變位點。分離獲得的CTCs 還可用于藥物篩選、耐藥性篩查、為腫瘤患者的個性化治療提供依據等。此外，CTCs 的發現和分離進一步加深了人們對腫瘤起源和轉移機制的認識，腫瘤干細胞、失巢凋亡抵抗、免疫逃逸等領域也得以更深入的研究[11-14]。

1.2 循環腫瘤DNA 循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是指腫瘤細胞死亡或破裂后釋放出來的遺傳物質，存在于腫瘤患者的循環系統中。ctDNA的發現得益于循環游離DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）的發現，cfDNA 是指來源于人體正常細胞的核酸物質，游離于人外周循環系統中。ctDNA是cfDNA 的一部分，僅指來源于腫瘤細胞的cfDNA，研究人員發現腫瘤患者循環系統中往往存在較高水平的ctDNA，且越接近腫瘤組織區域的ctDNA表達水平越高，而高水平的ctDNA 常提示患者預后不良，這些現象表明ctDNA 的發現對腫瘤診療領域具有極其重大的意義[15]。在腫瘤形成早期，人外周循環系統中便可檢測到ctDNA 的存在，而CTCs 尚未開始發生，這也就意味著ctDNA 對于腫瘤的早期檢測和防治至關重要。ctDNA 作為生物標志物，能隨腫瘤基因組的變化而改變，且具有更高的敏感性，動態變化的時效性，與腫瘤細胞基因組信息的一致性，這些特性使其被認為可能是腫瘤基因組的潛在替代物。因此利用ctDNA 監測腫瘤細胞基因組的實時變化，在腫瘤診療中具有極大地潛力。

1.3 細胞外囊泡 細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是指由細胞釋放的多種具有膜結構囊泡的統稱。根據其直徑不同，可分為外泌體（直徑30～150 nm）、微粒（直徑100～1000 nm）、凋亡小體（直徑50～5000 nm）和癌小體（直徑為1～10 μm），其中目前研究熱點為外泌體。起初，外泌體被歸類于“細胞垃圾”（cellular waste），科學家們認為這些囊泡物質并沒有特定的作用。直到近年來研究發現，外泌體攜帶有大量的生物學信息，包含多種基因型（如mRNAs、microRNAs、LncRNAs、circRNAs）和蛋白因子等，這些信息類物質主要來源于母細胞，并可以調節下游細胞的生物學功能，激活特定的信號通路，參與免疫應答，腫瘤演進等[16，17]。隨著外泌體分離和純化技術的提高，外泌體的提取變得越發簡便，純度也有明顯的提高，其所含有的大量生物學信息也逐漸被挖掘出來，對很多人類基礎疾病和癌癥中的重要作用也逐漸顯現[18]。但是要將EVs 的相關研究成果應用于臨床仍需解決一些技術難題，分離和鑒定EVs 的各個亞群需要更廣泛和普適性的技術革新，因此目前EVs 的價值主要還停留于實驗室的基礎研發階段。

2 液體活檢在腫瘤中應用

隨著癌癥監測和管理策略的不斷發展，對癌癥早期診斷、預后治療和耐藥性預測等的相關需求也日益增加。然而，盡管目前現有的分子藥物可用于靶向特定的基因組或蛋白組，但腫瘤的異質性仍然是個體基因組分析和診療方案中最大的障礙。針對這一現象，以CTCs 和ctDNA 構成的液體活檢診斷的核心，為癌癥治療和監管的新途徑鋪平了道路。液體活檢提供了一種無創的樣本收集途徑，在原發性腫瘤難以活檢的情況下，液體活檢可以作為有效的替代選擇，也可以作為實體腫瘤組織的補充活檢，其具有檢測疾病分子表征的優勢，這對精準醫學和以患者為導向的治療至關重要。

2.1 CTCs 為追溯黑色素瘤的起源，有研究采用從黑色素瘤患者體液中分離活CTCs 的方式進行定量和定性分析，結果發現分離細胞的免疫表型揭示了個體間的異質性與臨床結果相吻合[19]。CTCs 可用于判斷腫瘤患者預后及復發情況，評估腫瘤動力學，做到有效監測指導臨床治療。有明確的證據表明，CTCs 在早期乳腺癌中具有評估患者預后作用，但在日常實踐中仍缺乏臨床實用性，其局限性在于研究者需要根據上皮表面標志物的表達來評估CTCs的存在[20]。此外，CTCs 還被用于檢測肝細胞癌、結直腸癌、胰腺癌等腫瘤的生物標志物[21-24]。現今，CTCs在對某些晚期癌癥的化療療效和預后預測中也同樣發揮著重要作用。在非小細胞肺癌化療晚期，CTCs的陽性表達與遠處轉移及臨床分期有關，可作為敏感的化療療效監測及考核指標[25]。在乳腺癌中，CTCs 能夠較早發現微轉移，較好的輔助化療療效的評估。在不同分期的結腸癌中，CTCs 的表達與結腸癌的惡性程度存在相關性，臨床分期越高，CTCs陽性率越高，患者生存時間越短，其可作為判斷患者預后的指標[26]。

2.2 ctDNA 在腫瘤早期診斷中，液體活檢可以幫助對患者進行分類，并將篩查方式集中于高風險人群，從而減少副作用。在全身性治療期間，利用CTCs 和ctDNA 分析其對靶向療法的反應可能會有效增加臨床實踐的準確性。此外，ctDNA 和CTCs 中的基因組還可有效的標記相應的耐藥性突變基因。McEwen AE 等[27]通過提取中樞神經系統腫瘤患者腦脊液和外周循環血液中的ctDNA 進行研究，結果發現腦脊液中的ctDNA 明顯富集，且腦脊液中ctDNA 的突變與顱內過程最相一致。Moon SM 等[28]檢測了肺癌患者血液中CTCs 和ctDNA 常規腫瘤標志物的表達情況，以此評估兩者對腫瘤監控的敏感性，結果顯示，無論腫瘤分期或組織病理學類型如何，CTCs/ctDNA組合的敏感性明顯高于單獨使用CTC 或ctDNA，這表示聯合檢測的策略可能在臨床上更有用，可以增強肺癌的早期發現和診斷。ctDNA 在胃癌的早期診斷當中也有著非常明顯的指向性作用，其對于診斷結果的準確性提升有顯著的意義。另有研究指出[29]，在非小細胞肺癌中，ctDNA 在預測耐藥方面較臨床指標更加超前，是一項靈敏的檢測指標。同時，ctDNA 還可用于EGFR 基因突變檢測及EGFR 耐藥突變監測。總之，ctDNA 的定量檢測為臨床決策提供了便利和準確性，對肺癌、卵巢癌、食管鱗癌等多種腫瘤具有指導性意義[30-32]。

2.3 EVs 研究指出[33]，外泌體具有無創性腫瘤生物標志物的潛力，特異性檢測癌細胞來源的外泌體十分關鍵。外泌體中含有多種內源性貨物，部分內容物相當于其親代細胞并反映親代細胞的病理生理狀態，可檢測出與腫瘤相關的多種生物分子，這使其可能成為腫瘤早期診斷的特異性標志物。有研究發現[34]，胃癌患者外泌體的表達水平高于健康人群，外泌體的濃度有可能會成為胃癌的診斷指標。多項研究證明[35-38]，外泌體中包含的遺傳物質：mRNA、microRNA、LncRNA、circRNA 才是腫瘤特異性生物標志物的關鍵因素。目前EVs 的分離和檢測已取得重大進展，但于單個平臺上解決EVs 亞群的分離和純化才有可能促進EVs 技術的臨床應用。與此同時，通過對腫瘤EVs 進行廣泛分析來獲取更多的臨床驗證，也是EVs 得以量化其臨床潛力和在疾病進展中作用的必要條件。EVs 作為龐大生物學信息轉運的載體，在前期實驗室基礎研究中已展現出其在臨床腫瘤診斷和治療中的無限潛能。Melo SA 等[39]指出，胰腺癌患者的血清外泌體中存在過表達的磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican 1，GPC1），證明了外泌體蛋白作為胰腺癌早期診斷的可行性。外泌體攜帶的核酸信息物質在肝細胞癌、前列腺癌、胰腺導管癌、膀胱癌的早期臨床診斷中也起著決定性的作用[40-43]。雖然外泌體攜帶的mRNA 相對較少，但也有報道指出，外周循環血中的程序性死亡受體-配體1（programmedcell death-ligand 1，PD-L1）mRNAs 的表達與黑色素瘤和非小細胞肺癌的抗PD-1 抗體治療反應密切相關，這使外泌體mRNAs 成為腫瘤免疫治療的分子標志物，可能用于指導腫瘤化療合理用藥[44]。

3 總結

不同液體活檢生物標志物均具有其優點和局限性。由于CTCs 和ctDNA 的檢測原理、方法、技術和后續分析均存在較大差異，要解決這些問題，使液體活檢更好的應用于臨床工作，就必須將生物標志物檢測的特異性作為研究重點。其目的并非將一種生物標志物作為液體活檢的單一檢測對象，而是在于使用多種循環腫瘤標志物的協同作用，組成標志物的特定組合，來揭示癌癥的特異性，確定癌癥的狀態、起源和進展。但由于生物標志物的異質性和變異性，該判斷尚無定論。

液體活檢最終可替代標準組織活檢的程度尚不清楚。對于診斷原發腫瘤或確定難以提取樣品的組織中轉移灶的分期，液體活檢可能可提供可靠的選擇。液體活檢還可以幫助避免在侵入性組織活檢后發生并發癥，如出血、感染和疼痛等。多年來，研究人員已經明確液體活檢的臨床潛力。隨著分離檢測技術的標準化與新型標記物的發現，液體活檢將在腫瘤診斷、治療和預后評估方面擁有廣闊的應用前景。為了將其廣泛使用，目前需要進行更多的介入性臨床試驗，并開發出一種將適合的循環腫瘤標志物與疾病發展和轉歸組合在一起的算法。未來，相信這些檢測技術能真正意義上實現快速、可靠的檢測效果，最終解決更多的臨床問題。