髓核退變程度對軟骨終板干細胞生物學特性的影響①

伍耀宏，王長根

(1.贛州市人民醫院，江西 贛州 341000；2.尋烏縣人民醫院，江西 尋烏 342200)

隨著經濟發展的狀況和人口老齡化現象的發生，腰腿痛的人群越來越多[1]，給患者的生活帶來了諸多不便。目前，臨床上認為椎間盤退變是引起腰腿痛的主要原因，椎間盤退變引起腰腿痛是一個復雜的病理生理過程，是由多種致病因素(年齡、遺傳、職業、創傷、吸煙等)綜合作用引起椎間盤細胞數量減少和功能異常，但其發病機制尚不明確[2-3]。椎間盤是由髓核、纖維環和軟骨終板組成的，有研究表明能從這3種組織中分離出相應的干細胞[4-5]。鑒于此，本研究旨在探討髓核退變程度對軟骨終板干細胞生物學特性的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年12月至2020年6月贛州市人民醫院收治的脊柱退行性變患者13位。對13位患者腰椎進行MRI檢查，根據Pfirrmann分級標準[6]將Ⅰ、Ⅱ級患者分為輕度髓核退變組；將Ⅲ、Ⅳ級患者分為中度髓核退變組；將Ⅴ級患者分為重度髓核退變組。輕度組患者5例，平均(35.3±4.7)歲；中度組患者4例，平均(34.2±4.6)歲；重度患者4例，平均(37.7±5.2)歲。3組患者臨床一般資料無統計學差異(P>0.05)。詳見表1及圖1。

表1 Pfirrmann分級標準

1A：Pfirrmann分級Ⅰ級；1B：Pfirrmann分級Ⅱ級；1C：Pfirrmann分級Ⅲ級；1D：Pfirrmann分級Ⅳ級；1E：Pfirrmann分級Ⅴ級圖1 病例的Pfirrmann分級

1.2 排除標準

①患有血液系統疾病者；②腰椎外傷者；③患有脊椎感染性疾病者；④合并腫瘤疾病者；⑤影像資料不全者。

1.3 方法

取3組患者的椎間盤軟骨終板組織，放入含有DMEM/F12培養基的離心管中，用PBS清洗標本，分離軟骨終板、髓核和纖維環，將軟骨組織剪成1 mm3左右，放入0.25%胰蛋白酶在37 ℃的水浴箱10 min；0.2%Ⅱ型膠原酶和Ⅰ型膠原酶以1∶1的比列放置在37 ℃，5%CO2的培養箱中2 h，過濾得到CEMSCs；每2～3 d更換培養液，原代細胞形成單層后，加入0.25%胰蛋白酶消化，計數后按1∶3傳代。

1.4 觀察指標

①CEMSCs細胞活力；②CEMSCs細胞復蘇能力；③CEMSCs細胞凋亡率。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 CEMSCs細胞活力

根據熒光結果顯示，輕度髓核退變組患者的CEMSCs細胞活力較好，中度組患者其次，重度組患者CEMSCs細胞活力最差。詳見圖2。

2A：輕度髓核退變組；2B：中度髓核退變組；2C：重度髓核退變組圖2 CEMSCs細胞活力免疫熒光檢測

2.2 CEMSCs細胞凋亡情況

比較3組患者CEMSCs細胞凋亡情況，由實驗結果可以得知，輕度組凋亡最少，中度組其次，重度組最多。詳見圖3。

3A：重度組；3B：中度組；3C：輕度組圖3 CEMSCs細胞凋亡分析

2.3 CEMSCs細胞生物學特征

比較3組患者CEMSCs細胞生物學特征，包括細胞活力、細胞復蘇活力和凋亡率，根據實驗數據結果可以得知，輕度組患者的細胞活力和復蘇活力均最好，中度組其次，重度組最差(P<0.05)；輕度組細胞凋亡率最低，中度組其次，重度組最高(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組CEMSCs細胞生物學特征比較

3 討論

椎間盤是人體最大的無血管組織，其退行性變會造成椎間盤突出、椎管狹窄等問題，給患者諸多方面帶來不便，雖然其機制尚不明確，但有研究表明軟骨終板退行性變與椎間盤退行性變密不可分。軟骨終板功能在椎間盤退變機制中發揮重要作用，終板途徑是椎間盤營養通路的主要途徑，任何對此通路的干擾作用，都可能是影響椎間盤代謝的潛在危險因素[7-8]，而軟骨終板干細胞有修復椎間盤退變的作用[9]，因此，軟骨終板結構功能改變可能是引起椎間盤退變或者加重椎間盤退變的重要因素。本文就髓核退變程度對軟骨終板干細胞生物學特性的影響進行了研究。

臨床上早已證實椎間盤組織內含有內源性干細胞，CEMSCs作為軟骨終板的內源性干細胞，與其他外源性細胞相比，能夠更好地適應椎間盤組織的內環境以及能夠更好地向軟骨細胞分化。軟骨終板不僅是椎間盤的主要營養通路，還是維持脊柱生物力學的重要結構，其退行性變是從軟骨終板開始的，軟骨終板的變化在椎間盤病變中有著重要影響。由此猜測，CEMSCs細胞在椎間盤退化的過程中細胞的特性和生物學特征發生改變，這可能是導致椎間盤退變的一大重要因素。

本研究采用了新型的消化酶消化椎間盤組織來獲得CEMSCs細胞，此種方法操作簡單，耗時較短。本實驗中，原始CEMSCs細胞傳3代后，對CEMSCs細胞進行活力測定，由實驗結果可以得知，髓核退變程度較輕的CEMSCs細胞熒光活性較強，說明隨著髓核退變程度加深，CEMSCs細胞的活性降低。采用流式細胞術檢測CEMSCs細胞的凋亡率，由實驗結果可以得知，隨著髓核退變程度的加深CEMSCs的凋亡率上升，說明髓核退變程度影響著CEMSCs細胞的凋亡。亦有研究表明，椎間盤內部存在的凋亡異常與年齡的大小、退變的程度有關[10]，與本實驗觀點一致。有學者發現軟骨終板隨著外在壓力的增加，細胞凋亡的數量也會增加，且這種變化與MAPK信號通路有關[11]。椎間盤組織呈低氧、營養缺乏、高滲透壓內環境，在這樣的條件下，CEMSCs細胞易凋亡，凋亡相關蛋白BNIP3、Bax和Bak表達上調[12]。巨噬細胞遷移抑制因子是固有免疫的調控因子，在CEMSCs退變過程中高表達，可以通過與CEMSCs細胞表面CD74作用，抑制CEMSCs細胞的遷移。我們推測巨噬細胞遷移抑制因子可能是治療軟骨終板退變的新靶點。本實驗還對CEMSCs細胞進行了凍存與復蘇，由實驗結果可以得知，輕度組患者的細胞活力和復蘇活力最好，中度組其次，重度組最差，說明髓核退變程度會影響CEMSCs細胞的活力和復蘇，且隨著髓核退變程度的加深，CEMSCs細胞的活力和復蘇活力都會有所下降。

綜上所述，髓核退變程度影響軟骨終板干細胞的活性、凋亡和復蘇，髓核退變程度越高，軟骨終板干細胞的活力越低，凋亡越多，復蘇活力越弱。