大葉鉤藤中柯諾辛堿B及柯諾辛堿的含量測定及分析*

楊海船,張赟赟**,張 穎,巫 凱,李 嘉

(1.廣西壯族自治區中醫藥研究院化學室，廣西南寧 530022； 2.廣西中藥質量標準研究重點實驗室，廣西南寧 530022)

0 引言

鉤藤為茜草科植物鉤藤Uncariarhynchophylla(Miq.) Miq.ex Havil.、大葉鉤藤UncariamacrophyllaWall.、毛鉤藤UncariahirsutaHavil.、華鉤藤Uncariasinensis(Oliv.) Havil.或無柄果鉤藤UncariasessilifructusRoxb.的干燥帶鉤莖枝，秋、冬二季采收，去葉，切段，曬干[1]，具有息風定驚、清熱平肝的功效?，F代藥學研究表明，鉤藤主要具有鎮靜、降血壓、抗阿爾茨海默病和抗腫瘤等多種藥理作用[2-6]，吲哚生物堿是其主要的藥效物質，其中大葉鉤藤主要含有鉤藤堿、異鉤藤堿、柯諾辛堿(Corynoxine)、柯諾辛堿B (Corynoxine B)等生物堿。

目前，有關鉤藤化學成分的研究主要集中于鉤藤堿和異鉤藤堿，對柯諾辛堿B和柯諾辛堿的研究相對較少。通過查閱文獻和抗腫瘤篩選實驗證實，柯諾辛堿B及柯諾辛堿是鉤藤中很重要的抗腫瘤藥效物質。因此，本研究建立了運用HPLC同時測定柯諾辛堿B和柯諾辛堿的方法，并測定其在不同采收月份大葉鉤藤及其不同藥用部位中的含量，以期為鉤藤藥材質量標準的建立提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

Waters alliance E2695型高效液相色譜儀(美國waters公司),BS110S型1/10萬電子分析天平(梅特勒公司),B2200s 超聲波清洗器(必能信超聲有限公司)。

1.1.2 主要試劑

鉤藤藥材采自廣西南寧市高峰林場，經廣西中醫藥研究院黃云峰副研究員鑒定為大葉鉤藤(UncariamacrophyllaWall.)；柯諾辛堿(純度≥98，批號：BCY-0155)，柯諾辛堿B(純度≥98，批號：BCTG-0924)，均購自江西佰草源生物科技有限公司；色譜純甲醇(美國Fisher公司)；水為超純水；其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：246 nm；柱溫：25℃；流動相：甲醇-0.02%三乙胺(68∶32)；流速：1 mL/min；進樣體積：10 μL。色譜圖見圖1。

1.柯諾辛堿 B;2.柯諾辛堿2.Corynoxine B;2.Corynoxine圖1 混合對照品溶液(a)和大葉鉤藤樣品(b)HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference solution (a) and Uncaria macrophylla Wall.(b)

1.2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱定柯諾辛堿B和柯諾辛堿對照品適量，置于容量瓶內，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1 mL分別含0.13,0.296 mg的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

取大葉鉤藤藥材粗粉約1.0 g，精密稱量，置于具塞錐形瓶內，精密加入甲醇25 mL，密塞稱重，超聲提取40 min，放冷稱重并用甲醇補足失重，搖勻，用0.45 μm有機微孔濾膜濾過，制得供試品溶液。

1.2.4 耐用性試驗

用Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)等不同品牌色譜柱進樣測定，結果本品供試液中柯諾辛堿B和柯諾辛堿色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數分別按柯諾辛堿B和柯諾辛堿色譜峰計算，均不低于3 000，表明本方法在不同色譜柱的適用性良好。

1.2.5 線性關系考察

分別精密吸取1.2.2節混合對照品溶液1，3，5，10，15 μL，按1.2.1節色譜條件進行測定，以峰面積值(y)為縱坐標，各待測物進樣量(x)為橫坐標，分別繪制標準曲線。

1.2.6 精密度試驗

取同一份供試品溶液，按1.2.1節色譜條件連續進樣6次，測定各待測成分峰面積，峰面積相對標準偏差應小于等于2.00%

1.2.7 穩定性試驗

取同一供試品溶液，于制備后0,1,2,6,10,18 h分別進行測定，峰面積相對標準偏差應小于等于3.00%

1.2.8 重復性試驗

精密稱取同一樣品6份，每份約1.0 g，按1.2.3節方法制備供試品溶液，在1.2.1節色譜條件下進行測定，每份供試品溶液平行進樣2次，取平均值并計算供試品中各待測成分含量及其RSD。若待測成分含量為0.01%-0.10%，則RSD應小于等于4.00%；若待測成分含量在0.10%-1.00%，則RSD應小于等于3.00%。

1.2.9 加樣回收試驗

精密稱取已知含量(重復性實驗樣品)的同一批鉤藤藥材6份，每份約0.5 g，分別置于具塞錐形瓶中，每個錐形瓶中均精密加入7.00 mL混合對照品溶液(每1 mL混合對照品溶液含0.128 mg柯諾辛堿B，0.308 mg柯諾辛堿)和18.00 mL甲醇，按1.2.3節方法制備供試品溶液，在1.2.1節色譜條件下進行測定，計算回收率。

回收率%=(C-A)/B×100%，

式中，A為供試品中所含被測成分的量，B為加入對照品的量，C為實測值。

1.2.10 樣品測定

精密稱取供試品適量，按1.2.3節方法制備供試品溶液，按1.2.1節色譜條件進行測定，每份供試品溶液平行進樣2次，取平均值并計算供試品中各待測成分含量。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

由表1可知，各成分在各自的線性范圍內具有良好的線性關系。

表1 柯諾辛堿B和柯諾辛堿的線性關系考察結果Table 1 Results of linear relationship between corynoxine B and corynoxine

2.2 精密度試驗

供試品溶液中柯諾辛堿B和柯諾辛堿峰面積的RSD (n=6)分別為0.86%、0.74%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩定性試驗

柯諾辛堿B和柯諾辛堿峰面積的RSD分別為2.05%、2.82%，表明供試品溶液在18 h內穩定。

2.4 重復性試驗

柯諾辛堿B和柯諾辛堿峰面積的RSD (n=6)分別為1.48%、2.23%，表明該方法重復性良好。

2.5 加樣回收試驗

由表2可知，供試品中柯諾辛堿B和柯諾辛堿的平均回收率(n=6)分別為99.47%和100.06%，RSD分別為1.56%和0.98%，表明該方法準確度良好。

表2 大葉鉤藤中2種生物堿的加樣回收率(n=6)Table 2 Recovery rates of two alkaloids in Uncaria macrophylla Wall.(n=6)

2.6 樣品測定

根據表3的結果可以看出，不同月份采收的大葉鉤藤中柯諾辛堿B和柯諾辛堿的含量呈現無明顯規律的波動現象，其中，8月份采收的藥材中柯諾辛堿B和柯諾辛堿含量最高。

表3 柯諾辛堿B及柯諾辛堿含量測定結果Table 3 Content determination results of corynoxine B and corynoxine

3 討論

2020年版《中華人民共和國藥典》[1]規定鉤藤的藥用部位為帶鉤莖枝，采收季節為秋冬季節。鉤藤帶鉤莖枝在粉碎后常有較多纖維，很難繼續被粉碎成細粉，這些纖維主要存在于藥材的木質部中。因此，筆者將其單獨取出，與過篩后的細粉分別測定其中柯諾辛堿B和柯諾辛堿的含量。結果顯示，細粉中柯諾辛堿B和柯諾辛堿的含量要明顯高于纖維中的含量，提示柯諾辛堿B和柯諾辛堿很可能主要存在于大葉鉤藤帶鉤莖枝的皮部，在木質部中含量較低。帶鉤莖枝中的柯諾辛堿B含量明顯高于葉子，柯諾辛堿含量則略低于葉子，但兩個藥用部位中柯諾辛堿B和柯諾辛堿的含量之和卻相同，提示大葉鉤藤葉子可能也具有很好的藥用價值。這對于2020年版《中華人民共和國藥典》[1]中關于“去葉”規定的合理性提出一定的思考。表3結果表明，8月份采收的藥材中柯諾辛堿B和柯諾辛堿含量最高，這對藥典規定“秋冬季節采收”提供一定的數據支撐。

根據2020年版《中華人民共和國藥典》[1]記載，鉤藤項下只有1個薄層鑒別項，沒有含量測定項，質量控制指標還有所欠缺，質量標準有待完善。隨著中藥現代化、國際化的發展，人們對藥材質量標準的制定提出了更高的要求，一個能體現藥材藥理學特征和優良臨床價值的質量評價體系顯得越發重要，這就要求廣大科研工作者運用各種技術，獲取藥材環境、遺傳、性狀、化學、藥理等特征數據[7]。

4 結論

本研究方法可準確、快捷地測定大葉鉤藤中柯諾辛堿B和柯諾辛堿的含量，該結果可為大葉鉤藤的化學成分、適宜采收季節和藥用部位的研究提供科學數據。