植物病原卵菌效應蛋白RXLR和CRN研究進展

郭澤西 曲俊杰 劉露露 尹玲

(廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室 廣西南寧 530007)

從傳統的生物分類學來看，卵菌被認為是一種真菌。但從遺傳和系統發育學角度來看，卵菌在各個方面的表現更接近于藻類生物，如褐藻和硅藻等。盡管卵菌被界定為真菌類生物，但卵菌與真菌之間卻存在如下幾點的不同：（1）二者細胞壁成分不同，真菌多由幾丁質構成，而卵菌主要由纖維素構成；（2）卵菌菌絲基本上不會發生分隔，多是無隔菌絲體；（3）卵菌的營養體是二倍體，而真菌卻是單倍體；（4）卵菌不同于普通真菌的另一點是其游動孢子往往帶有雙鞭毛［1］。

近年來，研究比較多的植物卵菌主要包括疫霉屬（Phytophthora）、霜霉屬（Peronospora）、腐霉屬（Pythium）、假霜霉屬（Pseudoperonos‐pora）和白銹菌屬（Albugo）。目前已經完成大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）、馬鈴薯疫霉菌（Phytophthora infestans）、黃瓜霜霉菌（Pseu‐doperonospora cubensis）、擬南芥霜霉菌（Hya‐loperonospora arabidopsidis）、終極腐霉（Py‐thium ultimum）、十字花科白銹菌（Albugo can‐dida）、葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）等病原卵菌的全基因組測序［2-9］，這標志著對植物病原卵菌的研究逐漸深入到基因組層面。此外，根據現有的植物病原卵菌的基因組數據，利用生物信息學的數據分析手段，能夠更全面地闡釋不同類型的病原卵菌的致病機理，對理解病原卵菌的致病機制以及進化歷程都有積極影響。針對病原卵菌的致病機理研究主要在效應蛋白上。效應蛋白是指病原卵菌在侵入植物組織后分泌出的一種能夠影響植物體生長、發育等過程的小分子蛋白質［10］。本文對卵菌效應蛋白的挖掘方法、轉運機制和靶標蛋白篩選等研究熱點進行總結和概述。

1 卵菌效應蛋白的分類和挖掘

根據效應蛋白的靶標位置，將其分成胞外蛋白和胞內蛋白兩類。胞外蛋白，即指卵菌分泌的效應蛋白作用于植物細胞外，通過與植物細胞間的信號蛋白或植物細胞膜上的受體結合而發揮作用，也被叫做激發子。目前研究較多的激發子有：細胞壞死誘導蛋白（NLPs） 和各種蛋白酶抑制子［11］。胞內蛋白指分泌到被侵襲植物細胞內的蛋白，這類蛋白目前研究較多的有RXLR和CRN蛋白。

效應蛋白的傳統挖掘方法為圖位克隆。近年來，基因組測序和轉錄組測序技術的成熟，為快速高效挖掘效應蛋白提供了有利工具。當科學家完成了大豆霉菌的基因組測序后，發現大豆霉菌的效應蛋白致病機制非常復雜，在侵襲植物細胞的過程中往往同時涉及多達數百個功能蛋白［2］。

通過對圖位克隆方法得到的Avr3a、Avr1b 等多個效應蛋白的序列分析發現，這兩類效應蛋白的氨基末端的順序是穩定的［12-16］。這一研究結果證明，運用生物信息學分析方法來研究效應蛋白的科學性和合理性。研究表明，RXLR 效應蛋白的氨基端通常有RXLR-dEER 模塊序列，在羧基端則連接有不同的結構域。CRN 效應蛋白的氨基酸序列則與之不同，該類效應蛋白的氨基端往往連接有LXLFLAK 序列元件和DWL 結構域，在羧基端同樣包括多種多樣的結構域。基因組測序分析顯示，大豆疫霉約含有396 個RXLR 效應蛋白，擬南芥霜霉菌有134 個，橡樹疫霉菌有374 個，馬鈴薯疫霉菌有563 個，葡萄霜霉菌有100 個［17］。由此可見，RXLR 效應蛋白在卵菌中分布非常廣泛［2，4-5］。Tian等［18］的研究結果表明，黃瓜霜霉菌中除了RXLR效應蛋白外，還存在較多的QXLR 效應蛋白，推測QXLR 和RXLR 兩類效應蛋白可能具有相似的生物功能。CRN 效應蛋白在多樣性和數量上都遠遠低于RXLR效應蛋白。

2 RXLR轉運機制的研究

Guo 等［19］發現，革蘭氏陰性病原菌把自身產生的效應蛋白分泌到寄主細胞內，主要依靠其自身的Ⅲ型分泌系統，該過程對于研究病原菌的致病機理非常重要。鑒于該機理，研究人員逐漸找到了研究效應蛋白致病機理的切入點，即效應蛋白從卵菌中分泌后是如何轉運到宿主細胞的。初步研究顯示，卵菌分泌出效應蛋白后，這些效應蛋白必須要以某種方式穿過宿主細胞的細胞膜進入細胞內才能發揮相應的作用。該功能的實現往往取決于效應蛋白上的一段特殊轉運結構域序列，如RXLR［15，18］、LXLFLAK［11，19］和CHXC［20］。

RXLR 效應蛋白穿過細胞膜的機理研究比較多。RXLR 效應蛋白通常是由卵菌的吸器所分泌產生，其氨基端和瘧原蟲效應蛋白有很多相似之處。Marti 等［21］研究發現，瘧原蟲的效應蛋白穿越宿主細胞（紅細胞）的細胞膜主要依賴于其氨基端的Pexel基序，推測卵菌的效應蛋白穿過細胞膜也依賴RXLR-EER 片段。Whisson 等［22］通過實驗對此推論進行了驗證。實驗將致病疫霉菌的無毒蛋白Avr3a的氨基端特定序列和GusA基因進行融合，表達于特定的疫霉菌，并用該菌株對馬鈴薯進行侵染。結果發現，僅有菌絲周圍的葉片細胞表現出GUS活性。如果將該蛋白的氨基端RXLR-EER基序突變為RXLR-AAA、AAAA-AAA 或KMIK-DDK，侵染馬鈴薯后無法表現GUS 活性。Kale 等［23］對該結果進行了反復的實驗論證，結果表明，RXLR 效應蛋白結構上的結構域通過與植物宿主細胞膜上的PI3P 結合，調節相應的信號通路，使效應蛋白被宿主以內吞的方式進入宿主。然而，該機理并未得到業內的廣泛認可。Gan 等［24］經過實驗證明，亞麻銹菌的分泌的AvrM 和AvrL567 進入宿主細胞并不需要PIP3 的 參 與。Yaeno 等［25以AVR3a、AVR3a4 和AVR1b 三種常見的效應蛋白為研究對象，通過實驗無法重現RXLR 的氨基端序列與PI3P 結合。他們通過該實驗卻意外發現同PI3P 結合進而轉運至細胞內并非RXLR的氨基端，而是羧基端。他們還發現，AVR3a蛋白通過這種與宿主細胞膜上的PI3P結合而進入宿主細胞的過程能夠提高蛋白的穩定性。鑒于Bailey K 等［16，18］的研究結果，他們最終否認了AVR3a羧基端與效應蛋白轉運機理有關。

從上述研究結果可知，RXLR 效應蛋白轉運至宿主細胞的機理目前仍然不清楚，可能是通過多種途徑轉運進入。Stephan Wawra等［26］發現，寄生水霉菌分泌的SpHtp1 是通過與膜上的磺基酪氨酸結合來侵入寄主的。長期以來，人們認為瘧原蟲的效應蛋白的PEXEL/HT 基序在其內質網內被特異切割，在分泌前使其氨基端的序列被乙?；瑥亩蕴厥獾臋C制順利進入宿主細胞［27-28］。Bhat‐tacharjee 等［29］的研究表明，在宿主細胞的內質網上，PEXEL基序會同PI3P結合并被識別。這些研究充分表明RXLR 效應蛋白進入宿主細胞機理的復雜性和多樣性，也為進一步闡釋效應蛋白的轉運機理及作用機理提供參考。

3 靶標蛋白的篩選

3.1 RXLR效應蛋白的靶標

明確卵菌效應蛋白在寄主體內的靶標蛋白，對于理解效應蛋白的致病機理和參與植物免疫的蛋白組分都是非常重要的。

已經證實效應蛋白侵染植物進而干擾其免疫反應的類型是各種各樣的。大豆疫霉菌效應因子PSR1 和寄主體內一個RNA 解旋酶（RNA helicase）PINP1 蛋白相互作用，使小RNA 在植物體內的積累被抑制，植物自身的防御過程被擾亂，從而促進卵菌在宿主細胞內繁殖，使植物體染?。?0］。PsAvr3c 能夠與大豆細胞核前體RNA 剪接體蛋白GmSKPP 互作，進而負調控先天免疫［31］。PsAvh240與位于質膜上天冬氨酸蛋白酶GmAP1相互作用，進而抑制GmAP1的表達，從而抑制植物質外體免疫反應［32］。在馬鈴薯晚疫病菌中，PiAvrblb1和一個植物凝集素受體激酶LecRK-1.9 互作從而破壞植物細胞壁和質膜的穩定性幫助病原菌增殖［33］。PiAvr‐blb2在病原菌細胞膜表面和寄主蛋白酶C14互作并阻止其分泌［34］。Pi03192通過與可能參與免疫反應的轉錄因子NTP1 和NTP2 的互作來阻止其向細胞核的轉移來干擾免疫反應［35］。PiAvr3a效應蛋白和寄主細胞內的一個E3 泛素連接酶CMPG1 相互作用，并增加CMPG1 的穩定性，同時這種識別能夠被R 蛋白R3a 間接識別，并激活寄主的ETI 反應，產生HR和細胞壞死［36］。PiAVR2 和蛋白磷酸酶BSL1、BSL2以及BSL3 互作，負調控BSL1 和BSL3 抑制INF1 誘導的細胞死亡［37］。PexRD2 和MAPKKJKs 激酶結構域相互作用后，抑制細胞間的MAPK 的傳導途徑［38］。辣椒疫霉的RxLR207 會促進擬南芥中ACD11 的結合配體BPA1、BPL1、BPL2、BPL4 降解，通過調控活性氧（ROS）的濃度發揮免疫作用［39］。在擬南芥霜霉菌中，效應蛋白HaRXL44能夠和擬南芥體內一個調節亞基MED19a 互作，并抑制和水楊酸有關的基因表達［40］。HaRXL106 抑制水楊酸（SA）誘導的防御基因的轉錄激活，并改變植物對光的生長反應［41］。葡萄霜霉菌分泌的效應蛋白PvRXLR54 與葡萄葉綠素蛋白VvCBP151 直接互作，通過影響該葉綠素蛋白的光能吸收與轉化來抑制其先天免疫［42］。葡萄霜霉菌效應蛋白PvRxL13 與葡萄的轉錄因子HY5互作從而抑制其轉錄活性［43］。葡萄霜霉菌效應蛋白PvRxLR16 通過其W/Y/L 結構域與3 個預測糖基化位點來識別到葡萄中靶標蛋白為VaCUE［44］。

3.2 CRN效應蛋白的靶標

目前只有很少量的CRN 效應蛋白的靶標被發現。大豆疫霉菌分泌的PsCRN63 和PsCRN115 共同作用于宿主細胞的CAT1，使得宿主細胞內的PCD和過氧化氫維持在一個相對平衡的狀態，從而干擾宿主細胞的免疫過程［45］。宋天巧等［46］發現，PsCRN108 能夠調控宿主細胞的轉錄過程，該效應蛋白通過與宿主細胞的基因HSP90上的啟動子位點特異結合，使宿主體內無法正常表達防御蛋白，從而使宿主“順利”染病，這說明CRN效應蛋白能夠對植物細胞內的正常功能進行干擾。

4 展望

植物病原卵菌效應蛋白的致病機制一直是研究的重點和熱點。植物與病原卵菌在長期的侵染與免疫中，共同進化。病原卵菌分泌出的效應蛋白破壞寄主的免疫反應，寄主分泌相應的抗病蛋白來識別效應蛋白。目前，全基因組和轉錄組測序技術和生物信息學分析等技術的應用使得更多病原卵菌的效應蛋白被挖掘。這有利于闡明不同病原菌之間的致病性差異，為探索病原菌的致病機制和進化過程提供豐富的資源。然而，和真菌以及細菌相比，對卵菌的效應蛋白的靶標蛋白的了解比較少。病原卵菌的效應蛋白數量眾多，多數的效應蛋白與寄主之間的互作方式和效應蛋白之間的互作以及進入寄主細胞的轉運機制都尚未清楚。因此，還需做大量的研究來解析效應蛋白的致病機理和侵染過程等，為植物—病原物互作的分子機制研究提供理論依據和參考。