中國宮頸癌DNA甲基化標(biāo)志物的研究進(jìn)展

趙敬，楊金豪綜述，常艷敏，王蓉審校

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津 300052；天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，天津 300203；天津市南開醫(yī)院檢驗科，天津 300100）

我國每年宮頸癌新發(fā)病例數(shù)為13.3萬以上，其中約有2萬～3萬死亡病例，且近年來我國年輕婦女宮頸癌的發(fā)病率、死亡率均呈上升趨勢[1]。目前研究證實宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與DNA甲基化相關(guān)[2]。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為底物，將其提供的甲基基團(tuán)加在胞嘧啶的第5位碳原子上，發(fā)生甲基化修飾，基于GC配對的機(jī)制，mCpG會在雙鏈中對稱出現(xiàn)。DNA甲基化對于基因的表達(dá)有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。某些抑癌基因的啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化，可降低其轉(zhuǎn)錄活性，使抑癌基因表達(dá)沉默，導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常而產(chǎn)生惡性腫瘤。隨著對甲基化認(rèn)識的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)基因啟動子區(qū)異常甲基化是腫瘤發(fā)生的一個早期事件，是腫瘤早期診斷的非常有效的分子標(biāo)志。此外，在腫瘤的發(fā)展過程中，DNA甲基化的動態(tài)改變還可以反映腫瘤的嚴(yán)重程度分級、侵襲轉(zhuǎn)移及提示患者的預(yù)后。然而，由于種族，生存環(huán)境的不同，各國報道的宮頸癌DNA甲基化標(biāo)志物差異顯著。因此，本文對在中國婦女群體進(jìn)行實驗驗證的宮頸癌DNA甲基化標(biāo)志物做一總結(jié)分析，以期對后續(xù)的研究有所幫助。

1 宮頸癌高甲基化標(biāo)志物

細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常往往影響細(xì)胞增殖和分化的正常調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此可以把信號途徑相關(guān)的甲基化基因作為宮頸癌治療的重要靶點，通過對細(xì)胞信號途徑的干預(yù)，調(diào)整靶基因表達(dá)，使其恢復(fù)正常，以達(dá)到抑制腫瘤生長，治療腫瘤的目的。從我國近幾年報道的宮頸癌甲基化基因的生物學(xué)功能來看，主要集中在p53通路、凋亡相關(guān)、DNA修復(fù)、Ras信號通路、細(xì)胞循環(huán)(細(xì)胞周期)、細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)移和侵襲、Wnt通路等與癌癥發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的信號通路。

1.1 DNA修復(fù)DNA修復(fù)是細(xì)胞對其DNA受損傷后的一種反應(yīng)。MGMT(O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)是一種高效的DNA直接修復(fù)酶，能修復(fù)DNA序列中的6氧甲基鳥嘌呤的損傷，是人類細(xì)胞中迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一種修復(fù)該損傷的甲基轉(zhuǎn)移酶。簡生燕等[4]研究顯示，宮頸癌組織MGMT甲基化率可達(dá)71.15%；且與組織分化程度呈負(fù)相關(guān)，并影響其基因的mRNA的表達(dá)。

1.2 細(xì)胞周期p16（INK4A）是周期依賴性激酶抑制因子，人類許多腫瘤存在p16基因和蛋白的改變。在宮頸癌組織中p16甲基化率（26%）顯著高于癌旁正常組織，且隨病變程度加重呈現(xiàn)升高趨勢。此外，p16基因啟動子甲基化與宮頸癌的臨床病理特征有關(guān)聯(lián)，甲基化更多發(fā)生在年齡小于40歲、低分化的宮頸鱗癌患者；p16甲基化的發(fā)生是獨立于HPV感染的事件，它們在宮頸癌的致病過程中有可能是選擇性的作用于不同的時期。

FHIT基因?qū)儆诮M氨酸家族，吳慶華[5]首次在宮頸癌組織中揭示了FHIT基因5′端CpG島甲基化及其與基因失活的相關(guān)性。同期，史惠蓉等[6]又對宮頸癌及正常宮頸組織標(biāo)本進(jìn)行了檢測,結(jié)果宮頸癌標(biāo)本中40%出現(xiàn)FHIT基因甲基化而正常宮頸上皮標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)。任力群等[7]亦發(fā)現(xiàn)FHIT甲基化在宮頸癌組織（56.7%）中顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤樣變（CIN）組（14.3%）及慢性宮頸炎組（0）。鑒于FHIT甲基化在腫瘤組織的顯著性，研究者們期待將其轉(zhuǎn)化為臨床可應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物，對臨床獲取血清樣本的檢測發(fā)現(xiàn)，血漿FHIT甲基化的發(fā)生率與組織具有良好的相關(guān)性[8-9]。

SEPT9基因是GTP結(jié)合蛋白家族成員，參與細(xì)胞骨架的形成、細(xì)胞分裂和腫瘤的發(fā)生等。其基因啟動子的高甲基化已經(jīng)做為大腸癌的標(biāo)志物，最近研究顯示其亦可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，影響細(xì)胞周期的調(diào)控。其基因的甲基化對宮頸癌的診斷也具有良好的敏感性和特異性（AUC=0.854，P<0.001）[10]。

1.3 細(xì)胞凋亡 相關(guān)蛋白激酶1（DAPK1）是細(xì)胞凋亡正調(diào)控因子，是一種抑癌基因。我國Yang等[11]發(fā)現(xiàn)在60%宮頸癌組織、40%宮頸癌患者血漿中DAPK1啟動子區(qū)存在異常甲基化。而且還發(fā)現(xiàn)DAPK1基因啟動子區(qū)甲基化的程度與臨床病理學(xué)分級相關(guān)，且對于鱗癌細(xì)胞的檢出更敏感[12]。花敏慧[13]也得出了DAPK1甲基化在篩查宮頸癌和癌前病變的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為46.43%、97.92%、96.30%和61.04%。

1.4 細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)移和侵襲CDH1基因編碼E-鈣黏蛋白，屬于細(xì)胞黏附分子家族，介導(dǎo)相鄰的上皮細(xì)胞間依賴鈣的細(xì)胞連接，對于維持細(xì)胞分化、極性和正常組織結(jié)構(gòu)起重要作用。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)在75%的宮頸癌組織中CDH1蛋白表達(dá)缺失，且40%的宮頸癌組織中呈現(xiàn)高甲基化，此外，CDH1基因高甲基化與DNMT1的增加相關(guān)。Ren等[15]研究了宮頸癌血清樣本與組織標(biāo)本一致率達(dá)76.66%。陳勇等[16]還發(fā)現(xiàn)CDH1基因甲基化率與臨床病理特征相關(guān)。其甲基化率鱗癌組比腺癌組高，隨腫塊增大及FIGO分期升高而增高。

研究發(fā)現(xiàn)CADM1/TSLC1（細(xì)胞黏附分子1）在宮頸癌組織中異常甲基化率達(dá)66.2%，其中鱗癌67.8%，腺癌55.5%，宮頸上皮內(nèi)瘤變組織43.3%。此外，hrHPV感染的CIN 2/3到宮頸癌的演進(jìn)過程中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)由于啟動子甲基化引起的CADM1基因表達(dá)沉默，但是CADM1/TSLC1 mRNA在非瘤性HPV永生化細(xì)胞株中表達(dá)豐富，提示CADM1/TSLC1基因表達(dá)沉默可能與HPV永生化到致瘤性表型的轉(zhuǎn)化有關(guān)[17]。

EZRIN蛋白編碼細(xì)胞質(zhì)外周膜蛋白，主要是微絨毛的蛋白酪氨酸激酶底物作為ERM蛋白家族的一員，該蛋白主要在質(zhì)膜和肌動蛋白細(xì)胞骨架之間起作用。其在細(xì)胞表面的黏附、遷移和組織中起著關(guān)鍵作用，并與多種人類癌癥有關(guān)。

1.5 Ras信號通路 宮頸癌組織中RASSF1A基因的甲基化首先是在小細(xì)胞肺癌組織中被發(fā)現(xiàn)的，常處于失活狀態(tài)。最近也有研究顯示，RASSF1A基因在宮頸癌組織甲基化陽性率為35%，其甲基化率隨著臨床分期呈逐漸升高趨勢。同時，宮頸鱗癌的RASSF1A基因甲基化率明顯高于宮頸腺癌，但RASSF1A基因甲基化與宮頸癌的組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)[18]。

1.6 Wnt信號通路 正常的APC蛋白與Axin、Gsk-3β形成復(fù)合物可降解β-catenin，保證Wnt信號途徑對細(xì)胞特化、增殖以及遷移的正常調(diào)節(jié)[19]。APC基因表達(dá)異常使游離β-catenin增多，引起基因不正常表達(dá)，將導(dǎo)致細(xì)胞黏附、生長、分化等方面的重要改變，使細(xì)胞發(fā)生癌變。宋銀宏和張昌菊[20]研究發(fā)現(xiàn)APC啟動子區(qū)CpG島在Hela細(xì)胞中全甲基化，在Siha細(xì)胞中無甲基化。

SFRP1是Wnt信號通路的負(fù)調(diào)控因子，主要與FZ受體競爭結(jié)合Wnt蛋白，阻斷Wnt信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡。胡丹尼等[21]探討了SFRP1基因啟動子區(qū)甲基化與宮頸癌進(jìn)展的相關(guān)性。結(jié)果顯示，甲基化率大于80%的CpG多分布于CIN2/3和宮頸癌組織之中。Chung等[22]研究也證實SFRP1基因高甲基化與宮頸癌的進(jìn)展相關(guān)。

1.7 轉(zhuǎn)錄因子SOX家族基因參與性別決定、骨組織發(fā)育、血細(xì)胞形成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及晶狀體發(fā)育等多種組織器官的發(fā)育過程。目前，SOX1和SOX9甲基化與宮頸癌的關(guān)系在我國已有報道。張秀茹等[23]報道了宮頸癌組織中SOX1 CpG島的甲基化率大于50%，且與正常對照差異有統(tǒng)計學(xué)意義。巫劍紅等[24]則鑒定了SOX9基因的甲基化，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組平均甲基化分值高于正常宮頸組，鱗癌高于腺癌，G3高于G1/G2，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓的高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管癌栓的。

PAX1也是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與骨骼發(fā)育形成。Pax1的基因突變會導(dǎo)致嚴(yán)重的脊柱缺陷。分別采用MSP、QMSP和測序等多種方法對宮頸癌及宮頸癌前病變的PAX1甲基化率進(jìn)行了檢測和臨床評價，結(jié)果顯示Pax1基因甲基化率顯著高于正常組織，且隨著病變加重而增高，可應(yīng)用于臨床宮頸癌的篩查。

2 HPV基因組的DNA甲基化

DNA甲基化也可以調(diào)節(jié)HPV的基因表達(dá)。胡元晶[25]對HPV16 L1基因3′端和LCR基因進(jìn)行了測序。結(jié)果位于E6/E7啟動子的5個位點存在隨病情進(jìn)展甲基化水平逐漸降低的趨勢，宮頸癌組患者的甲基化水平最低。位于L1基因3′端的3個位點的甲基化水平在攜帶組、CIN組與宮頸癌組患者間比較有差異。由此推斷，HPV16甲基化狀況可能預(yù)測宮頸癌癌前病變或?qū)m頸癌的發(fā)生。

3 地區(qū)及種族特異性報道的甲基化基因

新疆是我國宮頸癌高發(fā)區(qū)之一，維吾爾族婦女宮頸癌患病率，病死率在全國少數(shù)民族中占第1位[26]。目前，報道過的和宮頸癌發(fā)生相關(guān)的甲基化基因包括DAPKTFPI-2CALCACADM1、SFRP1、P16、MDR1、CCNA1、APM、EGFR、hRFT2、IFITM1和HS3ST2等，與新疆維吾爾族婦女宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。瑪依拉·卡米力江等[27]認(rèn)為RAR基因高甲基化是維吾爾族宮頸癌演進(jìn)過程中的重要標(biāo)志。

此外，除了中國大陸，中國臺灣地區(qū)關(guān)于宮頸癌甲基化標(biāo)志物的研究也方興未艾。其中，LAI等[28-29]研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌DNA甲基化基因包括SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和ONECUT1等。近期研究顯示LMX1A、NKX6-1、PAX1、PTPRR、SOX1和ZNF582也是宮頸腺癌中出現(xiàn)的高甲基化基因[30]。

4 宮頸癌低甲基化標(biāo)志物

基因啟動子區(qū)異常甲基化是腫瘤發(fā)生的一個早期事件，是腫瘤早期診斷的非常有效的分子標(biāo)志。然而，目前大多數(shù)研究集中在高甲基化基因，而低甲基化基因報道較少。有報道STK31基因在HPV16/18陽性宮頸癌細(xì)胞系中，其啟動子/外顯子1呈現(xiàn)低甲基化，從而誘導(dǎo)HPV16E7/E6的整合[31]。也有報道長鏈非編碼RNA（lncRNA）SOX21-AS1低甲基化在宮頸癌中有著臨床預(yù)后價值，lncRNA SOX21-AS1在宮頸癌中參與的生物過程如表皮發(fā)展、脫皮周期、皮膚表皮及分子功能等，lncRNA SOX21-AS1作為一種腫瘤抑制因子，是一種良好的宮頸癌預(yù)后指標(biāo)[32]。

5 小結(jié)

DNA甲基化腫瘤標(biāo)志物由于其樣本來源廣泛，檢測方法簡便穩(wěn)定，并且可以實現(xiàn)高通量檢測，易于臨床轉(zhuǎn)化等優(yōu)點，而日益成為研究熱點。每年，歐美國家都有一些宮頸癌相關(guān)的新的甲基化標(biāo)志物不斷涌現(xiàn)，如荷蘭報道6個標(biāo)志物的聯(lián)合檢測法(ASCL1、LHX8、ST6GALNAC5、GHSR、SST、ZIC1)[33]。同時，歐美國家在積極推進(jìn)宮頸癌甲基化標(biāo)志物的臨床轉(zhuǎn)化。目前，荷蘭、德國已經(jīng)推出了商業(yè)化的宮頸癌甲基化的檢測試劑盒，包括PreCursor-M?，QIAsureMethylation Test?，GynTect，Oncgnostics?等[34]。相對于世界的研究水平，我國宮頸癌DNA甲基化的研究相對滯后很多，首先，缺少具有獨立知識產(chǎn)權(quán)的、針對中國婦女群體的宮頸癌甲基化標(biāo)志物；其次，目標(biāo)分散，缺少系統(tǒng)的大樣本群研究；再次，嚴(yán)重缺乏臨床轉(zhuǎn)化研究，缺乏在特殊人群如孕婦、人類免疫缺陷病毒感染患者群體的評價等，缺少對自檢樣本的檢測結(jié)果的評價，缺少隨訪研究等。最后，DNA甲基化標(biāo)志物要想真正進(jìn)入臨床，還需在方法學(xué)上進(jìn)行改善優(yōu)化，開發(fā)即時檢驗（POCT）產(chǎn)品；而持續(xù)深入研究這些甲基化基因的功能也是必不可少的；當(dāng)然，深入調(diào)查啟動子低甲基化的基因亦是未來的重要研究方向之一。