腫瘤細(xì)胞TRAIL 耐藥性的產(chǎn)生及緩解策略的研究進展

徐揚凱，任雨，樊曉驍

作者單位： 315000 寧波，寧波市泌尿腎病醫(yī)院

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）作為腫瘤壞死因子（TNF）超家族的一員，具有能夠特異性識別腫瘤細(xì)胞表達的促凋亡TRAIL 受體（TRAILR）的能力，進一步使其在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時對正常細(xì)胞不造成損傷。這一特性使得TRAIL 成為新型抗腫瘤藥物作用靶點的研究熱點，但同時部分腫瘤細(xì)胞極易產(chǎn)生針對TRAIL的耐藥性，使得其臨床應(yīng)用進展緩慢。因而，對腫瘤細(xì)胞TRAIL耐藥性產(chǎn)生機制的研究及研究如何緩解這一耐藥性是TRAIL相關(guān)治療方案未來發(fā)揮其臨床價值的關(guān)鍵。

1 TRAIL 及其受體

TRAIL 作為TNF 超家族（TNFSF）的一員于1995 年被Wiley 等[1]發(fā)現(xiàn)，也被稱為TNF 超家族因子10（TNFSF10）和細(xì)胞凋亡配體2（Apo2L）。與TNF 和細(xì)胞凋亡配體1（Apo1L）等類似，作為TNFSF 一員的TRAIL 也同樣擁有造成腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，并且在誘導(dǎo)凋亡的同時，TRAIL對正常組織影響極小，這一特點使得TRAIL介導(dǎo)的抗腫瘤治療受到廣泛關(guān)注[2]。

根據(jù)現(xiàn)有研究進展，已發(fā)現(xiàn)的TRAIL 受體共有5 種，依據(jù)能否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可分為兩大類。一類是可使細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)發(fā)生的TRAIL-R1 和TRAIL-R2，也分別被稱為死亡受體4（DR4）和死亡受體5（DR5），這兩者具有的共同特征即具有完整的死亡結(jié)構(gòu)域（DD），使得這類受體與TRAIL 結(jié)合后可激活下游凋亡通路[3]。另一個受體類別包含TRAIL-R3、TRAILR4 和骨保護素（OPG）這三者，其中TRAIL-R3 和TRAIL-R4 也被稱為誘騙受體（DcR），依次稱為DcR1 和DcR2[4]。DcR1和DcR2 雖然也是膜受體，但在受體結(jié)構(gòu)上與死亡受體差別較大，結(jié)構(gòu)上的缺陷決定了這二者均無法激活凋亡通路。這一類受體與TRAIL結(jié)合不但無法發(fā)揮其促凋亡的生理功能，還會出現(xiàn)DcR與DR的競爭，進而導(dǎo)致DR 激活不充分，使誘導(dǎo)凋亡作用減弱[5]。而OPG 作為可溶性受體同樣沒有死亡結(jié)構(gòu)域，其主要的生理功能為抑制破骨細(xì)胞的活動[6]。

2 TRAIL 誘導(dǎo)的凋亡信號通路

TRAIL 與DR4/DR5 結(jié)合后，使得死亡受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)死亡結(jié)構(gòu)域（DD）活化，而 Fas 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）通過DD 實現(xiàn)了與DR 的結(jié)合，同時通過死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）招募結(jié)合了同樣具有DED 結(jié)構(gòu)的胱冬肽酶原-8（procaspase-8）和procaspase-10。至此，上述所有因子構(gòu)成了一個統(tǒng)一的總體結(jié)構(gòu)，被稱為TRAIL死亡受體復(fù)合物（DISC）[7]。無活性的procaspase-8 經(jīng)過DISC 的激活和自活化成為有活性的胱冬肽酶-8（caspase-8）后，進入胞質(zhì)中并進一步活化下游caspase-3，從而進一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這一通路過程被稱為外源性凋亡通路，基于這一通路的細(xì)胞被稱為I 型細(xì)胞。而在II 型細(xì)胞中，X 染色體連鎖凋亡抑制（XIAP）蛋白的高表達使得caspase-3 活性遭到抑制，這使得單純依靠外源性凋亡通路無法充分活化足夠的caspase-3 誘導(dǎo)凋亡[8]。為了克服XIAP 對caspase-3 的抑制，一部分caspase-8 的生理功能轉(zhuǎn)化為裂解活化BH3相互作用域死亡激動劑（BID），使其成為有活性的截短型BID（tBID），之后tBID 進入線粒體中進一步激活下游的BCL-2 關(guān)聯(lián)蛋白X（BAX）與BCL-2 拮抗蛋白（BAK），這兩者導(dǎo)致線粒體外膜通透性增強（MOMP）[9]。MOMP 觸發(fā)下游機制，使得線粒體釋放出第二線粒體衍生胱天蛋白酶激活劑（SMAC），SMAC 是XIAP 的一種自然抗體，可以消除XIAP 對caspase-3 活性的抑制[10]。同時，MOMP 也使得細(xì)胞色素c（cytochrome c）從線粒體中被釋放出來，而后細(xì)胞色素c 與凋亡蛋白酶激活因子1（APAF1）和procaspase-9 一道共同構(gòu)成了凋亡體（Apoptosome），并進而產(chǎn)生了caspase-9，caspase-9 能增強caspase-3 的活化程度，從而加強凋亡誘導(dǎo)[9]。上述需要線粒體介導(dǎo)的凋亡誘導(dǎo)通路即被稱為內(nèi)源性凋亡通路。

3 腫瘤細(xì)胞TRAIL耐藥性的產(chǎn)生機制

通過對TRAIL 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路的研究發(fā)現(xiàn)，有效TRAIL 含量、TRAIL 受體情況以及信號通路相關(guān)蛋白表達情況均是影響TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵點。從理論上講，上述任意一方面出現(xiàn)異常，都是造成腫瘤細(xì)胞TRAIL耐藥的可能因素。

3.1 TRAIL 活性對耐藥性的影響TRAIL在人體中以同三聚體的形式發(fā)揮作用，但單純的三聚體形態(tài)穩(wěn)定性不足，容易被清除失活，導(dǎo)致誘導(dǎo)信號強度不足以發(fā)揮其促凋亡作用，繼而產(chǎn)生TAIL耐藥性[11]。TRAIL 耐藥性的產(chǎn)生也與TRAIL 靶向性不足有關(guān)，難以在腫瘤局部形成充分效價，同時為達到有效治療濃度需提高TRAIL的使用量，同時造成對肝腎器官的影響[12]。

3.2 TRAIL 受體對耐藥性的影響TRAIL只有與DR結(jié)合后才能介導(dǎo)后續(xù)凋亡通路，已有研究表明，若腫瘤細(xì)胞DR表達不足，或DcR 表達過量，則導(dǎo)致即使在TRAIL充足的情況下仍無法充分介導(dǎo)凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進而使腫瘤對TRAIL 的治療出現(xiàn)耐藥性[13]。同時研究表明部分腫瘤細(xì)胞存在網(wǎng)格蛋白依賴的胞吞作用（CME）及其介導(dǎo)的DR 胞吞現(xiàn)象，使得DR 盡管在mRNA 層面表達正常，但細(xì)胞表面的死亡受體仍偏少，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)TRAIL 耐藥性[14]。另有研究表明，細(xì)胞表面的死亡受體需要如糖基化（glycosylation）等進一步修飾才能實現(xiàn)富集及構(gòu)建DISC的功能，若修飾不足，如相關(guān)酶缺乏，也會出現(xiàn)耐藥性上升現(xiàn)象[15]。

3.3 信號通路因子對耐藥性的影響在凋亡信號通路傳導(dǎo)過程中，若促凋亡因子作用相對減少，或抗凋亡因子作用相對增強均有可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對TRAIL 的耐藥性。例如BCL-2 家族中同時存在促凋亡因子BID、BAX 和BAK，以及抗凋亡因子BCL-2 和BCLB，這類抗凋亡因子通過抑制MOMP 的發(fā)生對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，已有研究表明兩種凋亡因子表達失衡是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生TRAIL 抵抗的可能因素[16]。細(xì)胞型FADD樣IL-1 轉(zhuǎn)化酶（FLICE）抑制蛋白（c-FLIP）具有與caspase-8 高度同源的DED，可與caspase-8 在FADD 的結(jié)合上產(chǎn)生競爭，使得procaspase-8 無法活化[17]。同時有研究表明凋亡抑制蛋白（IAP）家族內(nèi)的細(xì)胞型IAP 蛋白1（cIAP1）和cIAP2 等因子與前述的XIAP相似，可通過對caspase 活化的抑制來影響細(xì)胞凋亡[18]。另有研究表明，由于細(xì)胞凋亡的復(fù)雜性，除了上述TRAIL誘導(dǎo)凋亡通路相關(guān)因子的異常可導(dǎo)致TRAIL 耐藥以外，還有其他凋亡通路因子如核因子- B（NF- B）[19]及Jun氨基末端激酶（JNK）[20]等均會對TRAIL耐藥的產(chǎn)生造成影響。因此，對凋亡通路的研究是明確TRAIL耐藥性產(chǎn)生的一大重點。

4 TRAIL 耐藥性的緩解策略

通過對TRAIL耐藥機制的研究，當(dāng)前針對耐藥性的緩解策略可分為三大類：第一類是對TRAIL進行修飾，通過在TRAIL上修飾基團或載體提高TRAIL 的穩(wěn)定性和靶向性；第二類是采用DR 的激動型抗體與DR結(jié)合，并激活凋亡通路；第三類是將TRAIL 與其他物質(zhì)聯(lián)合使用來提高腫瘤細(xì)胞對TRAIL 治療的敏感性。

4.1 經(jīng)修飾的TRAIL 已有學(xué)者通過修飾聚組氨酸（poly-histidine）和FLAG抗原表位（FLAG epitope）等基團增強TRAIL 三聚體的穩(wěn)定性；或添加具有靶向性的基團，如對應(yīng)抗原的IgG抗體，獲得了較好的抗腫瘤效果[21]。除上述修飾基團的策略以外，將TRAIL與載體進行結(jié)合來提高穩(wěn)定性和靶向性也是一大研究方向。De Miguel 等[22]通過將TRAIL修飾到脂質(zhì)體納米微粒的表面，發(fā)現(xiàn)其能在淋巴瘤細(xì)胞表面誘導(dǎo)出足夠DR5的表達與聚集，進而強化了DISC的產(chǎn)生和凋亡的發(fā)生。也有研究人員使用金納米顆粒作為載體成功提高TRAIL敏感性，其機制可能為發(fā)動蛋白相關(guān)蛋白1（Drp1）表達增強，進而導(dǎo)致線粒體裂解[23]。部分學(xué)者考慮到免疫反應(yīng)及納米微粒作為外來異物的抗原性，提出使用諸如人血白蛋白（HAS）等人體自身蛋白以及人體細(xì)胞作為載體來提高TRAIL 的穩(wěn)定性和有效性的想法，拓展了TRAIL載體的研究方向[24-25]。

4.2 死亡受體的激動劑 除修飾TRAIL 思路外，也有研究者考慮構(gòu)建高效穩(wěn)定的激動劑直接活化DR 誘導(dǎo)凋亡。但目前研究表明，單純使用DR 激動劑效果提升并不明顯，如Ciuleanu 等[26]對肝細(xì)胞癌患者進行了基于一種DR4 受體激動劑（mapatumumab）的二期臨床試驗，發(fā)現(xiàn)并不能有效提升患者的無進展生存期。基于此，構(gòu)建可激活多個受體的聯(lián)合激動劑是當(dāng)前的進展方向，如Brünker 課題組構(gòu)建了針對DR5 和成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）的聯(lián)合激動抗體RG7386，在抗腫瘤效應(yīng)方面較單抗體有了明顯的提升[27]。而Satta 等[28]構(gòu)建了CD3-DR5 聯(lián)合抗體，在活化TRAIL 相關(guān)細(xì)胞凋亡的同時，活化T 細(xì)胞啟動細(xì)胞免疫，提高了腫瘤細(xì)胞的殺滅效果。

4.3 TRAIL 的聯(lián)合用藥 將TRAIL 與化學(xué)藥物、生物提取物等聯(lián)用也是當(dāng)前破解TRAIL耐藥性的研究熱點，作用機制主要集中在對死亡受體的調(diào)節(jié)以及信號通路的影響。有學(xué)者將姜黃素與TRAIL 聯(lián)合應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)，與TRAIL 單用相比，二者聯(lián)用可顯著提高腫瘤細(xì)胞DR4與DR5 的表達，同時對c-FLIP、MCL-1及XIAP 等抗凋亡因子產(chǎn)生抑制作用，進而提高了TRAIL 的凋亡誘導(dǎo)效果[29]。中藥木蘭屬提取物和厚樸酚（Honokiol）同樣被發(fā)現(xiàn)具有增強TRAIL 敏感性的功能，其作用機制經(jīng)研究表明主要是對抗凋亡蛋白c-FLIP和生存素等的抑制，使TRAIL誘導(dǎo)的凋亡增強[30]。紫草科提取物乙酰紫草素（Acetylshikonin）也被證實可通過ROS家族活化p53/PUMA/BAX通路后增強肝細(xì)胞癌對TRAIL 治療的敏感性[31]。上述研究表明對中醫(yī)藥的進一步研究可有助于新型抗腫瘤療法的發(fā)現(xiàn)。

在化學(xué)藥物方面，Uddin等[32]發(fā)現(xiàn)一種蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制劑LB-100可有效抑制三陰乳腺癌細(xì)胞對TRAIL的耐藥性，PP2A被證明通過影響蛋白激酶B（PKB）使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生TRAIL 耐藥性。硼替佐米作為多發(fā)性骨髓瘤治療的一線藥物，基于人胃癌細(xì)胞株的實驗表明，其通過活化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）提高細(xì)胞表面DR5 的表達，其增強了TRAIL 誘導(dǎo)凋亡的效果[33]。甲狀腺未分化癌雖然罕見，但患者預(yù)后極差，而維莫非尼與TRAIL 的聯(lián)用方案在細(xì)胞和動物模型上均取得了良好的抑瘤效果，顯著提高了TRAIL治療的敏感性[34]。

5 結(jié)語

TRAIL因其具有針對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力而受到廣泛研究，但自身結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性及個別腫瘤易對其產(chǎn)生耐藥性，TRAIL 相關(guān)治療手段的臨床應(yīng)用仍很困難。隨著對TRAIL 致凋亡機制及耐藥機制的深入研究，如何緩解TRAIL 耐藥性的方法越來越多樣，從構(gòu)建重組TRAIL 聚合體到開發(fā)死亡受體激動劑，再到構(gòu)建TRAIL聯(lián)合用藥體系都各有亮點。雖然目前來看單一緩解策略仍無法全面解決TRAIL 治療存在的不足，對TRAIL耐藥機制的產(chǎn)生由于腫瘤細(xì)胞的差異仍有許多未知區(qū)域等待進一步探索，但當(dāng)前多個研究道路的開辟仍為將來把TRAIL 相關(guān)治療方案應(yīng)用于臨床實踐提供了理論依據(jù)。如果未來隨著后續(xù)研究的進一步深入，TRAIL 相關(guān)治療最終能應(yīng)用于臨床，這將為腫瘤的治療提供重要手段。