復方丹參滴丸治療急性心肌梗死作用機制的網絡藥理學研究*

孟天偉 常 虹

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150036；2.內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古 包頭 014040）

急性心肌梗死（AMI）是以冠狀動脈粥樣硬化為主要機制，在此基礎上，由于內膜損傷、血流變緩、血小板沉積等因素引起血栓形成，心肌供血進一步減少甚至中斷，使心肌嚴重而持久地急性缺血，即發生心肌梗死［1］。另外，心肌耗氧量增加或冠狀動脈痙攣也是誘發 AMI的條件因素［2］。AMI屬于中醫“真心痛”“厥心痛”的范疇，《靈樞·厥病》有云“真心痛，手足清至節，心痛甚，旦發夕死，夕發旦死”。由此可見該病具有病情重，病勢急的特點。經過歷代醫家總結發現本病為本虛標實證，本虛主要是以氣虛、陽虛、陰虛為主，其中心氣虛、心陰虛最為常見。標實主要有血瘀、氣滯、痰濕、寒凝，其中血瘀為該病最主要的病理特點，且常常夾雜于其他實邪之中。心陽虧虛，痰濁阻絡引發心痛也是臨床常見的一類癥型［3］。

復方丹參滴丸是由丹參、三七、冰片3種藥材經過現代工藝特殊加工制成的丸劑型中成藥，具有活血化瘀，理氣止痛的作用，對于氣滯血瘀型冠心病，胸悶、心前區刺痛的心絞痛或心肌梗死患者具有較好的療效?，F代醫學表明，復方丹參滴丸具有抗鈣超載、抗炎、抗氧化、抑制血栓形成等作用。任宏強等［4］發現，復方丹參滴丸可通過降低AMI大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白的表達水平來抑制AMI細胞凋亡。李建等［5］發現復方丹參滴丸能抑制AMI患者左心室重構，且副作用小。復方丹參滴丸是第一例通過美國認證的復方中成藥，在其治療AMI的眾多研究中，更多的是對于復方丹參滴丸治療AMI的單靶點、單通路的作用機制的相關研究。本次研究采用網絡藥理學的方法構建藥物、靶點以及相關通路的網絡圖，將可能治療疾病的相關靶點和通路展示，為后續的研究提供參考和依據。

1 資料與方法

1.1 復方丹參滴丸化學成分的獲取及相關靶點篩選在中藥系統藥理數據庫及分析平臺TCMSP（https：//tc?mspw.com/tcmsp.php）以復方丹參滴丸中主要成分丹參、三七、冰片的名稱為關鍵詞進行檢索，獲取復方丹參滴丸中各化合物的相關信息。并以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，半衰期（HL）≥4 h作為篩選指標，篩選出符合條件的有效成分。再通過Swiss Target Prediction［6］（http：//www.Swisstargetprediction.ch/）查找單個成分作用的靶點，將靶點輸入至UniProt（https：//www.uniprot.org/）數據庫中，校正基因名稱。

1.2 急性心肌梗死相關靶點篩選 以“Acute myocar?dial infarction”為關鍵詞通過DisGENET數據庫（http：//www.disgenet.org/）以及 DrugBank數據庫（http：//www.drugbank.ca/）檢索疾病靶點，選取基因和疾病的相關性平均值以上的靶點，以保證此次研究的準確性。

1.3 復方丹參滴丸治療急性心肌梗死的核心靶點篩選將藥物靶點與疾病靶點映射獲得相關治療靶點，并將這些靶點輸入STRING數據庫（https：//string-db.org/）獲得蛋白互作信息，篩選閾值高于0.900的高置信度互作信息。使用Cytoscape3.8.0［7］軟件構建復方丹參滴丸與AMI疾病靶點網絡，并通過軟件中的Network Ana?lyzer功能進行網絡拓撲分析，篩選節點自由度大于平均值的靶點作為核心靶點。

1.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 使用Omicshare（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）平臺對核心靶點進行GO二級分類富集分析，物種選擇“智人”運行獲得生物過程，分子功能，細胞成分分析結果。利用DAVID平臺（https：//david.ncifcrf.gov/）對核心靶點進行基因組百科全書KEGG（kyoto encyclope?dia of genes and genomes）通路分析，篩選P值<0.01，頻次在10次或10次以上的條目，認為這些通路在復方丹參滴丸治療AMI的過程中起到重要作用，以此來獲得顯著性較高的分析結果。

1.5 “化合物有效成分-靶點-通路”網絡構建 利用Cytoscape 3.8.0軟件對復方丹參滴丸化合物有效成分、核心靶點與通路之間的關系進行可視化處理，構建“化合物有效成分-靶點-通路”的網絡藥理圖，以便于后續的分析研究。

2 結果

2.1 復方丹參滴丸化合物、活性成分及潛在靶點的收集與篩選 通過TCMSP篩選獲得符合條件的丹參的化合物40個，三七的化合物7個，冰片的化合物3個。獲得靶點1 965個，篩除重復后共獲得靶點445個。將復方丹參滴丸中的50個化學成分以藥物名稱拼音加代號的方式代替，以便后續構圖。對應列表如表1所示。

表1 復方丹參滴丸化合物成分匯總表

續表1-1

2.2 AMI靶點的篩選 通過DrugBank數據庫共檢索到疾病靶點數量為34個，DisGENET數據庫共檢索到疾病靶點數量為766個，以基因和疾病的相關性（Score_gda）的平均值為篩選標準，選擇數值在0.0213以上的靶點共151個，兩個數據庫共獲得靶點185個，篩除重復靶點后最終獲得靶點數量159個。

2.3 復方丹參滴丸治療AMI的核心靶點篩選 將藥物靶點與疾病靶點映射后獲得治療靶點61個，通過“1.3項”的方法，獲得靶蛋白相互作用網絡如圖1，運用Cytoscape3.8.0構建“藥物成分-疾病靶點”網絡，如圖2所示。通過拓撲分析篩選出自由度大于平均值8.018的靶點24個，認為這些靶點為核心靶點，結果如表2所示，并構建“有效成分-疾病靶點”核心網絡圖，如圖3所示。在網絡中，某個節點的自由度代表在本網絡中該節點與其他節點相互作用的數目，若自由度的值越大，則證明該節點的重要性越高，其中羧酸酯酶1（CES1）的自由度為23，是本網絡中度值最大的靶點，因此復方丹參滴丸治療AMI的過程中，該靶點起到關鍵作用。

表2 核心靶點

圖1 復方丹參滴丸治療AMI靶點PPI網絡

圖2 “復方丹參滴丸-有效成分-疾病名稱-疾病靶點”網絡圖

圖3 “有效成分-疾病靶點”核心網絡圖

2.4 GO富集分析與KEGG通路富集分析結果 復方丹參滴丸治療AMI的GO富集分析如圖4～圖5所示。由圖可知，這些核心靶點可以通過細胞的生物過程，細胞的代謝過程，細胞對刺激的反應等方面影響生物過程；通過離子結合、催化活性、分子功能調節劑等方面影響分子功能；通過細胞器、細胞膜、細胞膜部件、細胞外區等方面影響細胞組成。以P值<0.01，頻次在10次或10次以上的條目為篩選條件，共篩選出復方丹參滴丸治療AMI的KEGG通路富集分析25條，結果如表3所示。從表3可知，復方丹參滴丸治療AMI可能與多種通路相關，可能通過調節癌癥的途徑、HIF-1信號通路、TNF信號通路等相關。利用Cytoscape對藥物有效成分、核心靶點與通路之間的關系進行可視化處理，構建“化合物有效成分-靶點-通路”的網絡藥理圖，如圖5所示。在各通路中癌癥通路自由度最大為21，該通路可能是復方丹參滴丸治療AMI的關鍵通路。

表3 復方丹參滴丸治療AMI的KEGG通路富集分析

圖4 復方丹參滴丸治療AMI的GO富集分析柱狀圖

圖5 復方丹參滴丸治療AMI的GO富集分析氣泡圖

3 討 論

本次研究發現復方丹參滴丸通過丹參酮、積雪草酸、槲皮素等50種化合物共同作用于MAPK8、CASP3、CES1等24個核心靶點，并通過調節癌癥的途徑、HIF-1信號通路、TNF信號通路等發揮治療AMI的作用。

丹參作用于AMI的有效化合物成分主要是酮類，丹參酮ⅡA具有降低AMI后心律失常的發生率、擴張血管的作用，從而降低心梗死亡率。單宏麗等［8］發現丹參酮ⅡA通過MAPK信號通路和SRF信號通路抑制miR-1從而改善心肌離子通道失衡，保護心肌。三七主要通過槲皮素等化合物，發揮著抗炎和抗動脈粥樣硬化的作用。唐玉等［9］發現槲皮素通過抑制細胞間黏附分子表達，保護AMI患者的心肌。積雪草酸為冰片治療AMI的主要化合物。史艷霞等［10］發現積雪草酸通過調節Nrf2/HO-1以及NF-κB來改善AMI大鼠的心肌損傷；榮霞等［11］發現積雪草酸抑制SIRT3/β-catenin/PPARγ信號通路可以對AMI大鼠的心肌組織起到一定的保護作用。MAPK8基因是MAP激酶家族中的一員。MAP激酶參與多種細胞過程如增殖、分化和轉錄調控。該激酶激活多種細胞刺激和目標特定的轉錄因子，從而調節即早期基因表達對細胞刺激的反應。有研究表明，MAP激酶對于T細胞的增殖、凋亡和分化發揮著關鍵作用。CASP3（半胱天冬酶3）在細胞凋亡中起著至關重要的作用，而細胞凋亡的失敗是癌癥的重要標志之一［12］。CES1是CES（羧酸酯酶）家族中的一員，CES屬于藥物代謝酶的第一階段，該家族可以水解各種藥物酯、酰胺、氨基甲酸酯和類似結構［13］。有學者［14］發現，一些功能CES1基因變異的（例如G143E）可能損害血管緊張素的激活，從而影響血管緊張素高活性化合物的治療結果。

圖6 化合物有效成分-靶點-通路

癌癥通路涉及血管生成、細胞增殖等過程。癌癥主要是由基因改變引起的，因為基因改變導致維持細胞動態平衡的基因調控網絡紊亂。多數癌癥是由各種環境因素造成的體細胞突變和生殖細胞突變共同作用引起的。然而，多數突變位于基因組位置上缺乏蛋白編碼能力的區域，其中包括以RNA分子發揮功能的基因區［15］。HIF-1信號通路在多種心血管疾病、炎癥等過程中發揮重要作用。HIF-1蛋白是缺氧狀態下調控血管新生的重要分子［16-17］，HIF-1作為內源性保護分子在缺血缺氧性腦血管疾病、急性心肌梗死等疾病中對神經細胞的存活和心肌細胞的再生具有重要意義。萬俊等［18］發現HIF-1α反義寡核苷酸對BMMSCs治療AMI具有抑制作用，BMMSCs對大鼠AMI的部分治療作用可能是通過HIF-1α介導的。TNF家族目前已經發現30多種細胞因子，研究表明TNF具有殺傷和抑制腫瘤細胞、提高中心粒細胞的吞噬抗感染等生物學活性，因此，TNF不僅是一種可引起腫瘤壞死的循環因子，同時也可被確定為調節炎癥反應的關鍵因子。血管內皮細胞對TNF因子的反應是經歷一系列促炎性改變，增加白細胞黏附、跨內皮遷移和血管滲漏，促進血栓形成［19］。

綜上所述，本次研究充分證明復方丹參滴丸可以通過多個藥物化合物成分作用于多個AMI靶點，再對有效靶點進行通路分析后發現復方丹參滴丸通過癌癥的途徑、HIF-1信號通路、TNF信號通路等多條通路對AMI進行治療和調控?，F階段對于復方丹參滴丸治療AMI的通路研究并不全面，而有些相關通路如：癌癥的途徑、TNF信號通路等并未被提及或研究。此次研究不僅佐證了前期對復方丹參滴丸治療AMI的研究結論，同時研究出新的治療AMI的靶點方向與相關通路，為后續的研究提供新的思路和方向。