超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飼料中的喹諾酮類和四環(huán)素類藥物含量

黃志偉，李洪波，劉利曉，趙盼盼，馮 晉

駐馬店市獸藥飼料（動物產(chǎn)品）質(zhì)量檢驗監(jiān)測中心，河南駐馬店463000

喹諾酮類又稱吡啶酮酸類或吡酮酸類，其化合物結(jié)構(gòu)中含有4-喹諾酮環(huán)，是人工合成的抗菌藥。因其抗菌譜廣，價格低，在畜禽養(yǎng)殖中被廣泛使用（王金秋等，2014）。喹諾酮類藥物的長期濫用會導(dǎo)致在畜禽動物體內(nèi)蓄積，進而通過食物鏈影響人類健康（Hoelzer 等，2017；Marshall 等，2011；王志杰等，2010）。四環(huán)素類抗生素（TCs），其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬氫化并四苯環(huán)衍生物，由放線菌產(chǎn)生（粟慧等，2018），被廣泛用于多種細菌及立克次氏體、支原體、衣原體感染的治療，同時也會引起很多不良反應(yīng)，如消化道反應(yīng)，肝、腎損害，影響牙齒和骨骼的發(fā)育等（鐘偉龍等，2012）。基于飼料中非法添加物和抗生素的重大危害，歐盟從2006 年起就禁止在動物飼料中添加抗生素類藥物（王湘如等，2019；顧欣等，2013）；我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也禁止促生長類抗生素在動物飼料中的使用。因此為保證動物飼料安全，進而保障畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全，有必要建立飼料中抗菌藥物多通量同步聯(lián)合檢測檢驗方法。目前，關(guān)于喹諾酮類和四環(huán)素類的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法都有報道（陶婭等，2017；封家旺等，2015；郝向洪等，2015），但同時檢測喹諾酮類和四環(huán)素類的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析法鮮見報道。本實驗旨在建立同時檢測喹諾酮類和四環(huán)素類的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，為快速篩查、檢驗檢測飼料中喹諾酮類和四環(huán)素類藥物的違規(guī)使用和非法添加情況提供技術(shù)保障。

1 材料和方法

1.1 儀器 Acquit UPLC-Xevo TQ-S 質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters 公司）；TTL-DCⅡ氮吹儀（北京同泰科技發(fā)展有限公司）；3-30k 臺式高速冷凍離心機（Sigma 公司）；AG125 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；IKAMS3.Basic 圓周振蕩器（廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司）；VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；Waters Oasis HLB 固相萃取柱（3 CC/60 mg）。

1.2 試劑 乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉均為分析純，實驗用水為經(jīng)mili-Q 凈化系統(tǒng)制備的去離子水；恩諾沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星購于Dr.Ehrenstorfer.GmbH；土霉素購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；鹽酸四環(huán)素和鹽酸金霉素購于中國藥品生物制品檢定所；多西環(huán)素購于中國食品藥品檢定研究院。

Mcllvaine-Na2EDTA 緩沖液的制備：分別稱取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉10.9 g，乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水900 mL 溶解，用1 mol/L 氫氧化鈉溶解調(diào)節(jié)pH 至（4.0±0.5），加水稀釋至1000 mL，即得。1%甲酸甲醇的制備：取甲酸1.0 mL，加入甲醇99.0 mL，充分搖勻，即得。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制 分別稱取適量的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、土霉素、金霉素、四環(huán)素和多西環(huán)素對照品，用甲醇溶解并稀釋成約1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；并于-20 ℃下避光保存。該標(biāo)準(zhǔn)儲備液在使用時，先恢復(fù)至室溫，然后稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取 稱取飼料試樣2 g（精確到0.01 g），置于50 mL 離心管內(nèi)，加1%甲酸甲醇10 mL，渦旋混勻1 min，振蕩提取10 min，超聲10 min，6000 r/min 離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50 mL 離心管內(nèi)。1%甲酸甲醇10 mL 重復(fù)提取一次，合并提取液，渦旋混勻1 min。準(zhǔn)確量取提取液1 mL 于10 mL 離心管中，加入Mcllvaine-Na2EDTA 緩沖液5 mL，渦旋30 s，加水10 mL 混勻后，作為待凈化溶液。

1.4.2 樣品凈化 HLB 固相萃取柱，依次用3 mL甲醇和3 mL 水活化。待凈化溶液全部過柱，依次用3 mL 水和5 mL 5%甲醇淋洗，擠干。用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，50 ℃氮氣吹干，準(zhǔn)確加入2 mL 20%乙腈溶解殘渣，過0.22 μm 濾膜后供超液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

1.5 實驗方法

1.5.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLCTM BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；柱溫：40 ℃；流動相A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈；進樣量：2 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測MRM；離子源溫度：150 ℃；霧化溫度：500 ℃；霧化器流速：1000 L/Hr；錐孔氣流速：150 L/Hr；毛細管電壓：1.2 kv；定性、定量離子對及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 喹諾酮類和四環(huán)素類定性、定量離子及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系 精密吸取100 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)混合中間液0.025、0.05、0.1、0.2、0.5 mL 于1.5 mL 離心管中，分別加入0.5 mL 空白凈化液，分別加入20%乙腈水溶液0.475、0.45、0.4、0.3、0.0 mL，渦旋混勻，配制成2.5、5、10、20、50 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，并依次上機，以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（表3），可以看出9 種化合物在2.5～50 μg/L 內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.995 以上。

表3 喹諾酮類和四環(huán)素類的保留時間、線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 檢測限和定量限 向空白飼料試樣中添加適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)處理上機。根據(jù)特征質(zhì)量色譜峰的信噪比S/N＞3 為檢測限，S/N＞10 為定量限，檢測到喹諾酮類藥物、四環(huán)素類藥物的檢測限為0.025 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg。

2.3 方法的靈敏度和準(zhǔn)確度 在空白飼料中添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，制備成含量為0.05、0.1、0.25 mg/kg 三種濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)添加試樣，每個濃度做5 個平行，連續(xù)做3 批，其平均回收率、批內(nèi)（批間）變異系數(shù)如表4。喹諾酮類和四環(huán)素類的回收率為74.7%～93.2%，批內(nèi)、批間的相對偏差均小于15%。喹諾酮類空白飼料添加色譜圖見圖1，四環(huán)素類空白飼料添加色譜圖見圖2。

圖1 空白飼料中添加0.1 mg/kg 的喹諾酮類藥物特征離子質(zhì)量色譜圖

表4 飼料中喹諾酮類和四環(huán)素類的回收率及RSD（n=5）

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件的優(yōu)化 喹諾酮類和四環(huán)素類均具有兩性基團，屬于酸堿兩性化合物，在水溶液中以離子形式存在，通常選用酸性溶液作為流動相組成成分（彭麗等，2014；錢卓真等2010）。在使用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm 粒徑1.7 μm）作為色譜柱條件下，分別嘗試了甲醇、乙腈、甲酸、乙酸、水多種配比流動相條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相能獲得較好的峰型和較高的響應(yīng)。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 首先分別將喹諾酮類和四環(huán)素類（100 ng/mL）標(biāo)準(zhǔn)溶液流動注射進樣，以正離子模式進行一級質(zhì)譜圖掃描，發(fā)現(xiàn)這些藥物的［M+H］+峰均比較強，故選擇［M+H］+作為母離子。然后進行子離子掃描，最終分別選擇響應(yīng)值較高的兩個子離子作為定性和定量離子，并優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，使其相應(yīng)的響應(yīng)值達到最大。

3.3 樣品前處理條件的優(yōu)化 由于飼料樣品中基質(zhì)成分比較復(fù)雜，蛋白質(zhì)、脂類和無機鹽類含量高，利用目標(biāo)化合物中堿性基團，采用酸化有機提取溶液提取。經(jīng)過多次實驗最終確定用1%甲酸甲醇溶液作為提取液回收率最好。為減少基質(zhì)干擾，降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，需對提取樣品進一步凈化。本實驗分別考察了MCX、C18 和HLB 固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLB 固相萃取柱回收率較高，批內(nèi)變異系數(shù)相對較小，最終選擇HLB固相萃取柱作為凈化柱。同時對淋洗條件進行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨使用水淋洗都有較大的基質(zhì)干擾，采用10%甲醇淋洗，標(biāo)準(zhǔn)溶液添加回收率明顯降低；因此采用依次用水和5%甲醇淋洗，并且增加5%甲醇淋洗量為5 mL，甲醇洗脫，最終得到了滿意的實驗結(jié)果。

不同種類的飼料組成成分差異較大，最終產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)的大小也不同，本研究采用空白飼料做添加回收實驗，同時用該空白飼料的基質(zhì)工作液校正，能得到滿意結(jié)果；但不同種類空白飼料偏差較大。尤其是四環(huán)素類藥物，受金屬離子的干擾較大，因此本方法不適合礦物質(zhì)預(yù)混合飼料的檢測。本研究將5 種喹諾酮類藥物和4 種四環(huán)素類藥物作為目標(biāo)化合物進行實驗探索，同時優(yōu)化樣品前處理條件、色譜條件和質(zhì)譜條件，建立了飼料中同時檢測喹諾酮類和四環(huán)素類的UPLC-MS/MS 方法，并且其準(zhǔn)確度和靈敏度能滿足飼料檢測的需要。