病毒核酸試劑盒開發(fā)的質量控制

姚燕麗，吳靜標，潘曉芳，韓芝斌，柯杰馳

廣東省醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗所 （廣東中山 528437）

根據(jù)2019年中華醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會和國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心聯(lián)合制定的《液體活檢在臨床腫瘤診療應用和醫(yī)學檢驗實踐中的專家共識》[1]，檢測已知、單個靶向治療敏感或耐藥型突變時，建議使用突變擴增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）憑借原理簡單、操作性強、價格較低、靈敏度高、特異度好、及時方便的優(yōu)勢成為現(xiàn)階段伴隨診斷的主流技術，在基礎研究以及醫(yī)學診斷、法醫(yī)學和農(nóng)業(yè)科學等各大領域的應用廣泛。PCR作為臨床診斷的金標準技術，還被廣泛應用于血站核酸檢測、疾控核酸檢測、臨床核酸檢測等領域，其中，在傳染病診斷和血篩檢測中能夠縮短診斷的“窗口期”，并且可以定量對病原體進行檢測，相比于傳統(tǒng)的免疫診斷方式，其具有不可替代的優(yōu)勢，且基于PCR 的分子診斷是醫(yī)院對傳染性疾病診斷的金標準[2]。

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是目前應用最成熟、分子診斷臨床應用最廣泛的技術平臺，尤其是在傳染性疾病（病毒性肝炎、性病和其他病菌/病毒類等）和腫瘤伴隨診斷領域[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計，截至2020年11月11日，國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）共批準了846個PCR 類產(chǎn)品，其中qPCR 產(chǎn)品占比高達86.54%。在伴隨診斷領域，NMPA 批準的伴隨診斷產(chǎn)品中有60%都是基于qPCR，而在美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的46個伴隨診斷產(chǎn)品中，基于qPCR 的產(chǎn)品占比也高達 32.61%（15個）。

產(chǎn)品委托檢驗是體外診斷試劑盒上市前產(chǎn)品性能驗證重要且不可或缺的一個環(huán)節(jié)，是產(chǎn)品第一次走出企業(yè)、真正面臨第三方的質量考驗。產(chǎn)品檢驗過程中總是會出現(xiàn)一些共性問題，作為第三方注冊檢驗機構，本研究從試劑盒產(chǎn)品性能評估的企業(yè)參考品的設計過程質量控制和病毒核酸檢測試劑制樣過程、擴增條件的優(yōu)化過程質量控制這兩方面的共性問題進行總結討論，闡述企業(yè)在試劑盒研制中可能要注意的質量控制點。

1 企業(yè)參考品設計過程中的質量控制

1.1 企業(yè)參考品的原料

企業(yè)參考品的原料應盡可能與待檢樣本基質一致并盡量使用臨床真實滅活樣本，但考慮到多數(shù)病毒的生物傳染性，采用臨床樣本時應充分有效滅活以防止其成為新的傳染源[3-5]。在企業(yè)的實際研發(fā)中，對到底采用合成質粒還是病毒樣顆粒作為企業(yè)參考品的原料一直有爭議。在使用企業(yè)參考品檢測試劑盒性能時，如果使用合成質粒將無法監(jiān)控核酸提取和逆轉錄過程，使產(chǎn)品可能處于失控狀態(tài)，而使用病毒樣顆粒則可以模擬病毒的全過程，進行有效的產(chǎn)品質量控制[6]。

此外，企業(yè)參考品的原料應該經(jīng)過定值并有相應的定值溯源過程[7]。目前，采用人工合成基因大多使用紫外分光光度計檢測并計算分子數(shù)的方法，此方法會存在極大的誤差，直接影響到檢測限的確定，從而導致產(chǎn)品性能評估誤差，影響臨床使用。故在進行定值時應該選擇更可靠的方法，如將目標核酸與已有國際/國內標準物質的核酸合成為一個基因組，并用國際/國內標準物質作為標準曲線進行量值傳遞來實現(xiàn)，從而更有效保證產(chǎn)品質量。

1.2 企業(yè)參考品

通過對企業(yè)參考品中陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品、檢測限參考品的合理設置可以對檢測試劑盒產(chǎn)品的性能指標進行有效評估，同時也是企業(yè)出廠檢驗和質量控制的主要手段。

1.2.1 陽性參考品

陽性參考品反映產(chǎn)品檢測不同濃度的陽性樣本的能力，即產(chǎn)品準確性，一般由高、中、低不同濃度樣本組成[4-5]。在病毒核酸檢測試劑中，陽性參考品一般可以將臨界值的樣本設置為弱陽性參考品，將接近檢測上限或醫(yī)學上限的濃度設置為強陽性參考品，在弱陽性參考品和強陽性參考品之間選擇設置中陽性參考品[8]。

1.2.2 陰性參考品

陰性參考品主要考察產(chǎn)品的特異性，應盡可能包括干擾樣本和健康人樣本[8]。干擾樣本分為內源性和外源性，應是與待測物可能發(fā)生干擾的物質、病原體或與取樣過程中相關的微生物、相似癥狀的病原體、相關治療藥物的不同濃度的樣本。部分的體外診斷企業(yè)采用了合成質粒而不是滅活病毒作為陰性參考品，這種方法對于特異性的驗證是不利的，因為合成的質粒只是病毒的基因片段而不是全序列基因組，并不能全面評估試劑盒的特異性。

1.2.3 精密度參考品

精密度參考品反映了產(chǎn)品的重復性，一般包括不同濃度的弱陽和中陽性樣本。在檢測次數(shù)上一般為檢測10次，通過計算10次檢測的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）確定試劑盒的精密度，一般產(chǎn)品的精密度≤10%[9-10]。

1.2.4 檢測限參考品

檢測限參考品是評價產(chǎn)品的一個重要指標，體現(xiàn)產(chǎn)品檢測靈敏度。確定檢測限需要進行大量的樣本測試和統(tǒng)計學分析，而檢測限參考品則只是對已確定的檢測限進行驗證。在企業(yè)參考品中至少應該設置3個不同梯度的檢測限參考品，每個檢測重復3次，直至不能全部檢出為止[9-10]。

2 產(chǎn)品設計過程中的質量控制

試劑盒大部分是由核酸提取試劑、擴增試劑、質控品組成，各個成分的開發(fā)環(huán)節(jié)與質量控制密切相關，而對制樣過程和擴增條件的優(yōu)化直接影響試劑盒質量[3]。

2.1 制樣過程

2.1.1 核酸提取試劑

核酸提取試劑一般包括蛋白殼的裂解、洗滌、洗脫等步驟。部分病毒屬于單鏈核糖核酸（single-stranded ribonucleic acid，ssRNA）病毒，容易被提取過程中的RNA酶降解[11]，需要加入RNA 酶抑制劑并對提取的過程進行充分優(yōu)化，同時在產(chǎn)品說明書指定配套的提取試劑，以保證擴增樣本質量。在應用過程中，大部分企業(yè)只提供擴增試劑和質控品，對于提取試劑的適配性沒有充分研究，同時因為病毒的基因組比較短[11]，若不對提取過程進行質量控制監(jiān)控，如再遇到內標設置不當時，則難以保證核酸提取的純度。因此，應對配合使用的核酸提取試劑/方法的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證。

2.1.2 質控品

質控品需要參與提取，是擴增質量控制的有效手段之一。質控品一般由含檢測目標的陽性質控和不含檢測目標的陰性質控組成。質控品首先推薦充分滅活的臨床樣本，其次為病毒樣顆粒，并保證質控品與樣本檢測同時進行，提高檢測的準確性。質控品的濃度選擇是檢測過程中產(chǎn)品特異性、檢測限、準確性的集中體現(xiàn)，質控品的濃度過高不僅可能產(chǎn)生額外的污染，還無法評估檢測能力，而質控品的濃度過低則可能導致檢測失敗，從而導致更多的復測，一般高于試劑的檢測限濃度5倍即可，具體還需參考產(chǎn)品的重復性參考品進行設置[11]。

2.2 擴增條件的優(yōu)化

擴增試劑質量的高低是檢測成功與否的關鍵。擴增試劑主要由緩沖液、逆轉錄酶（檢測RNA 病毒時）、聚合酶、引物探針組成，同是應盡可能加入防污染的酶系，有效防止PCR 產(chǎn)物污染。退火、變性的溫度和時間、鎂離子濃度（或錳離子）、核酸模板純度、dNTP 濃度、引物序列和長度的設計都是擴增條件優(yōu)化需要考慮的因素[12]。

另外，對于試劑盒內標的選擇也是影響擴增效果的關鍵，完善的內標可以監(jiān)控臨床樣本從采樣、提取、擴增整個完整流程，防止因樣本量少、操作不當、試劑失效等因素產(chǎn)生的假陰性，有效提高對應病毒疾病的診斷準確性。一般選擇內源性的內標可以監(jiān)控從采樣到擴增的全過程，外源性的內標則最多只能監(jiān)控從提取到擴增的過程。目前，市場上的部分企業(yè)沒有設置內源性或外源性內標（如噬菌體），大大增加了假陰性結果和復測的工作量[13]；即使部分企業(yè)設置了內源性內標（如看家基因GAPDH 等），但是為了產(chǎn)品出廠檢驗速度卻降低了標準，沒有對整個產(chǎn)品進行有效的質量控制。試劑盒同時設置內源性的內標和外源性的內標可以多效監(jiān)控試劑盒的整個檢測過程。

3 小結

企業(yè)參考品的設計定值和核酸檢測試劑制樣過程、擴增條件的優(yōu)化過程構成了病毒核酸試劑盒的配方開發(fā)全過程。配方研發(fā)人員首先是產(chǎn)品的設計師，而不只是性能的調試員。配方開發(fā)方案的設計，需要與后續(xù)產(chǎn)品轉產(chǎn)結合起來。首先，企業(yè)所開發(fā)試劑的生產(chǎn)條件是可實現(xiàn)的；其次，設計開發(fā)的配方在生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生的潛在風險是可規(guī)避的，即必須結合實際生產(chǎn)過程中會出現(xiàn)的各種問題驗證試劑的穩(wěn)定性；最后，生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品設計和開發(fā)時應充分評估和驗證產(chǎn)品的主要原材料，特別是對引物和探針的選擇，同時考慮臨床樣本的復雜性和多樣性，進行必要的臨床陽性樣本的驗證，以此來評估試劑盒產(chǎn)品的有效性。只有設計的精確，才能確保配方開發(fā)階段的質量控制無誤，這需要研發(fā)人員具備較強的產(chǎn)品意識。

試劑盒開發(fā)質量控制應始于配方開發(fā)之時，貫穿于從產(chǎn)品立項到出廠整個過程中。若配方開發(fā)階段的質量控制是一個靜態(tài)的過程，那么產(chǎn)品設計轉換階段則是動態(tài)的控制過程。而產(chǎn)品的設計轉換階段又可以分為兩部分，即工藝設計驗證和工藝轉換。工藝設計驗證是與配方階段的銜接，是產(chǎn)品可行性的驗證，如極端生產(chǎn)環(huán)境的驗證和風險的調配控制，甚至對配方參數(shù)進行進一步的優(yōu)化。工藝轉換更側重后期量產(chǎn)，要做好放大生產(chǎn)方法的建立、產(chǎn)品批間差控制與生產(chǎn)過程的匹配，放大方法的建立對試劑盒而言最重要的是三大傳遞的放大，即動量傳遞、質量傳遞和熱量傳遞的放大；產(chǎn)品批間差控制包括小試批間差和放大生產(chǎn)后批間差控制，這都對設計轉換人員綜合素質要求較高，要求其對任何可能導致批間差的物理或化學因素進行排查并解決。

綜上所述，試劑盒產(chǎn)品開發(fā)的質量控制體現(xiàn)在每一個關鍵環(huán)節(jié)的設計理念，體現(xiàn)在對開發(fā)細節(jié)的控制，同樣體現(xiàn)在各個合作部門之間的協(xié)作，要求研發(fā)人員具備一定的產(chǎn)品意識，生產(chǎn)人員需要有一定的研發(fā)思維，設計轉換人員則需要起到樞紐作用，保證各個環(huán)節(jié)連貫不脫節(jié)，才能實現(xiàn)真正的質量控制。