基于角膜共聚焦顯微鏡的神經纖維人工智能分析方法

吳 俊，費思佳，沈 博，張瀚文，黃劍鋒，潘 琦，趙建春，丁大勇

1西北工業大學電子信息學院，西安 7100722中國醫學科學院 北京協和醫學院研究生院，北京100730國家老年醫學中心 中國醫學科學院老年醫學研究院 北京醫院 3眼科 4內分泌科， 北京 1007305北京致遠慧圖科技有限公司人工智能實驗室，北京 100872

糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病最常見的慢性并發癥之一，患病率約50%[1- 4]。目前DPN的診斷大多依賴于臨床癥狀體征以及電生理檢查等[4- 5]，而這些傳統檢查方法多用于診斷大神經纖維病變。近年研究發現，在DPN發病過程中，小神經纖維最早出現損傷[6- 7]，故小神經纖維的檢查技術可用于DPN的早期診斷。通過皮膚活檢量化表皮內神經纖維密度(intraepidermal nerve fiber density, IENFD)是當前評估小神經纖維損傷的金標準，但IENFD是一種侵入性檢查，具有臨床應用性差以及可重復性不強的局限性[3- 4,8]，故亟需一種快速、可重復、定量測量小神經纖維的無創技術。角膜共聚焦顯微鏡(corneal confocal microscopy, CCM)正是這樣一種技術[3], 在DPN診斷中具有良好的應用前景。本文就CCM評估糖尿病神經病變的臨床應用研究以及CCM相關人工智能分析方法進行闡述。

1 CCM與角膜神經

角膜是人體神經支配最密集的部分，每平方毫米約有7000個痛覺感受器，是皮膚敏感度的300～600倍[2,9]。絕大多數角膜神經纖維為感覺纖維，起源于三叉神經眼支[9- 10]，自角鞏膜緣呈放射狀分布，經睫狀神經節后纖維進入角膜，隨后大部分神經束穿過Bowman 層，在Bowman 層和角膜上皮基底膜之間形成密集的角膜基底下神經叢[1,8,11]。借助角膜的透明性這一優勢，CCM可直接可視化和量化角膜神經纖維，并通過二維掃描、多個圖像實時映射或者三維圖像清晰地顯示角膜基底下神經叢。

可用于評估角膜神經病變的參數包括角膜神經纖維密度(corneal nerve fiber density, CNFD)，即每平方毫米神經纖維主干的數量；角膜神經分支密度(corneal nerve branch density, CNBD)，即每平方毫米從神經纖維主干分出的分支數量；角膜神經纖維長度(corneal nerve fiber length, CNFL)，即所有神經纖維包括分支的總長度和神經纖維扭曲度或扭轉系數(tortuosity coefficient, TC)。

CCM能夠重復檢測上述參數的變化[12- 13]。而目前已有研究證實由糖尿病引起的周圍神經病變與CCM檢測到的角膜基底下神經叢的改變密切相關[1- 2,11]。

2 CCM在評價DPN中的作用

2.1 早期診斷DPN

2.1.1 診斷價值

有研究指出角膜神經纖維的改變是DPN的早期跡象，CCM可比電生理學和振動感覺檢測更早發現周圍神經纖維異常[13]。Chen等[5]對 61例1型糖尿病(diabetes mellitus type 1，T1DM)患者和26名匹配的健康受試者(對照)進行了CCM和皮膚活檢量化IENFD評估神經病變，結果顯示CCM與IENFD的診斷效率相當(用于識別DPN的AUC值：CNFL為0.82，CNFD為0.80，IENFD為0.66，P=0.14)。Ziegler等[6]通過CCM、皮膚活檢量化IENFD和神經生理學測試確定86例新發2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者和48名匹配的健康受試者的早期神經損傷，同樣認為CCM和IENFD均可早期識別小纖維損傷，CCM可作為早期檢測神經病變的無創檢查工具。

Asghar等[14]對37例糖耐量受損患者和20名年齡匹配的健康受試者進行了神經傳導功能檢查、定量感覺測試、皮膚活檢量化IENFD和CCM等對神經病變進行全面評估，結果在糖耐量受損患者中用IENFD和CCM均檢測到了神經病變的證據，由此推斷CCM可預測DPN的發生。Szalai等[15]采用CCM發現了無臨床神經病變的T1DM患者的角膜神經纖維缺失，Yan等[16]在無臨床神經病變表現的T2DM患者中觀察到了角膜神經纖維病變。以上研究均支持CCM在DPN的二級預防中發揮著重要作用。

2.1.2 影響DPN診斷價值的角膜神經參數

Jiang等[17]基于大樣本量薈萃分析顯示，與對照組和無DPN的糖尿病患者相比，DPN患者的CNFD、CNBD和CNFL顯著降低，而TC變化并不顯著，認為TC對于識別DPN仍存在爭議。Tavakoli等[7]對101例糖尿病患者和17名健康受試者進行了CCM檢查，發現CNFD、CNFL、CNBD隨著神經病變嚴重程度的增加而顯著降低，并指出CNFL可作為診斷DPN的最佳參數。本研究中心對98例T2DM患者和30名年齡匹配的健康受試者進行神經傳導速度及CCM檢查，以神經傳導速度異常作為診斷DPN的金標準，繪制角膜神經參數CNFL、CNFD、CNBD的受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線，發現CNFL為診斷DPN的最佳參數(靈敏度：82.4%，特異度：85.7%)[18]。絕大多數研究已證實CNFL是評估DPN最可靠的參數，并認為角膜神經參數在左、右眼之間無顯著性差異，且與糖尿病的類型無顯著相關性，但目前采用角膜參數評估DPN仍存在局限性，例如由于CNFL和CNFD值會隨著年齡的增長而減少[1,8]，因此建議制訂年齡標準化的角膜參數參考值范圍。

2.2 評估DPN嚴重程度

Malik等[10]收集了18例患有不同級別神經病變的糖尿病患者和18名年齡匹配的健康受試者的Bowman層圖像，與健康受試者相比，糖尿病患者的CNFD、CNFL和CNBD值均降低，且隨著神經病變嚴重程度的增加，上述參數值逐漸降低，這一發現具有里程碑意義。Ferdousi等[19]對143例T1DM和T2DM患者(其中無神經病變51例、輕度神經病變47例、中重度神經病變45例)以及年齡匹配的30名健康受試者進行了定量感覺測試、神經傳導研究和CCM，結果顯示與對照組相比，T1DM和T2DM患者的CNFD、CNFL和CNBD值均降低，且隨著神經病變的加重，CNFD(個/mm2)(26.61±1.05比24.47±1.09比22.4±1.14,P<0.0001)、CNFL(mm/mm2)(23.31±0.96比20.84±1.004比19.27±1.04,P=0.002)和CNBD(個/mm2)(64.07±4.39比58.49±4.76比45.60±4.5,P<0.0001)進一步降低。上述研究均提示可通過CCM檢查評估DPN嚴重程度。

2.3 監測、評估療效

角膜神經叢也被用作判斷糖尿病干預療效的形態學指標之一。研究顯示，糖尿病患者采取措施改善血糖控制，特別是糖化血紅蛋白改善后，角膜神經可再生，在接受胰腺移植的T1DM患者中，術后6個月CNFD、CNBD和CNFL均有所改善，提示角膜神經叢可作為手術干預后的次要預后指標[2]。此外，在一項對25例輕至中度神經病變糖尿病患者的前瞻性研究中，角膜神經形態隨血糖控制的改善而有所改善[20]。CCM的優勢在于可通過重復檢查評估干預措施是否有效，未來研究需確定CCM參數的改善是否預示著傳統神經病變預后指標如神經傳導速度的改善，以及患者臨床預后(如疼痛、截肢和生活質量)的改善。

3 CCM在評價糖尿病自主神經病變中的作用

糖尿病自主神經病變(diabetic autonomic neuropathy, DAN)的早期診斷較困難，而心血管自主神經病變(cardiovascular autonomic neuropathy, CAN)是臨床上DAN最重要的類型。目前通常采用心血管反射試驗評估DAN，但這種方法因受伴發的心血管疾病以及血管活性藥物的影響，靈敏度和特異度有限[21- 22]。Tavakoli等[22]對19例伴DAN的糖尿病患者和15例不伴DAN的糖尿病患者以及18名健康受試者進行了CCM評估，證明CCM對DAN具有良好的診斷價值。Maddaloni等[23]對36例T1DM患者和20名健康受試者進行了自主神經病變評估以及CCM檢測，結果發現T1DM患者與健康受試者相比，CNFD、CNBD、CNFL均降低，而CAN患者的CNFD顯著降低。早期診斷和干預對于預防DAN進展至關重要，而CCM或許有望成為DAN早期無創診斷的選擇。

4 CCM在評價糖尿病微血管并發癥中的作用

部分研究證實糖尿病患者角膜神經病變早于視網膜病變和腎臟病變，Petropoulos等[24]對53例T1DM患者[ 37例伴有糖尿病視網膜病變(diabetes retinopathy, DR)，16例不伴有DR]和27例健康受試者進行了CCM、微量蛋白尿等評估，結果顯示與對照組相比，不伴有DR的患者CNFD、CNBD、CNFL顯著降低，且伴有DR的患者比不伴有DR的患者CNFD、CNBD、CNFL進一步降低；不伴有微量蛋白尿患者的CNFD、CNBD和CNFL顯著降低，伴有微量蛋白尿患者的CNFD、CNBD和CNFL進一步降低。Srinivasan等[25]確定了CNFL的降低是T1DM患者DR惡化的預測因素之一。上述研究提示CCM可能是干預和預防微血管并發癥進展的最早機會窗口，由于糖尿病微血管并發癥患病率較高，未來需進行更大規模的前瞻性研究以確定CCM用于預測糖尿病微血管并發癥的價值。

5 人工智能在CCM神經纖維圖像分析中的應用

臨床研究表明，DPN與角膜神經纖維丟失有關。通過CCM圖像能夠對DPN進行定量評估，并有潛力成為理想的替代指標。其在識別糖尿病患者發生DPN風險方面具有預測能力，并已被用于顯示神經纖維修復的幾項臨床干預研究[26]。DPN與神經纖維醫學指標的相關研究均表明，CCM檢查能夠實時、可對比地觀測角膜神經纖維形態和分布的變化，在DPN患者的前期檢測、中期發展、療效判斷等多種時期的診斷過程中發揮關鍵作用。

交互式人工分析被用于從這些CCM圖像中獲得測量值，如CNFD、CNFL、CNBD等[27]。但這種人工分析手段通常存在耗時長、工作量大、易受主觀因素影響、定量結果的重現性差(尤其是CNBD)等問題，給實際臨床應用帶來了相當大的困難，尤其在進行縱向隨訪研究時[7]。因此，迫切需要一種自動化的檢測方式以獲得CCM圖像的神經纖維參數，為醫生提供有效的輔助診斷工具。角膜神經纖維參數自動提取算法是檢測DPN的一種客觀、可復現的手段。

基于CCM圖像的DPN輔助診斷研究對糖尿病的診斷與治療意義重大，早預防、早發現、早治療是目前糖尿病患者最好的治療方法。然而目前在CCM圖像神經纖維自動化檢測方面的研究相對較少。整體而言，CCM圖像神經纖維自動化檢測分為兩個階段：(1)CCM圖像神經纖維自動分割，把CCM圖像以像素為單位標記為神經纖維和圖像背景；(2)CCM圖像神經纖維參數(CNBD、CNFD、CNFL等)的自動計算。

Dabbah等[28]提出了一種多尺度“雙模型濾波器”(dual-model filter，DMF)，可將基于偶對稱實值Gabor小波變換的前景提取模型與根據噪聲級別對輸出進行縮放的低通高斯背景提取模型相結合，對CCM圖像中的神經纖維進行提?。皇褂米钚【秸`差算法，計算以特定圖像像素為中心塊的局部神經纖維方向，全局應用低通高斯濾波器進行圖像背景的提取。Chen等[29]在此研究基礎上進行優化，采用基于金字塔結構的像素級特征向量，利用隨機森林分類器、形態學優化方法等估計神經纖維在每個像素位置的方向，最終得到神經纖維的分割結果圖。

Kim等[30]基于神經纖維形態提出一種分割方法，但這種方法存在對比度低和聚焦不精準的問題。隨著人工智能和深度學習的發展，深度學習模型也被運用到這一領域中。陳新建等[31]應用改進后的U-Net進行CCM圖像神經纖維分割，融入多尺度分離與融合模塊增大感受野，獲得了較為有效的CCM圖像神經纖維分割結果。為了提升深度學習模型的準確性，Williams等[32]獨立訓練了5個深度學習CCM圖像神經纖維分割模型，并采取對同一位置分割結構多模型結合投票的機制，有效提升了深度學習模型分割結果的準確性。

Yildiz等[33]提出了一種新的基于生成性對抗網絡(generative adricative network，GAN)的深度學習算法，以實現對于CCM神經圖像的分割。該研究收集了85名受試者的活體角膜共焦顯微鏡(invivocorneal confocal microscopy, IVCM)圖像，由3名臨床醫生完成數據標注，分別對基于U-Net和GAN的2種圖像分割方法進行訓練和測試。結果顯示，基于GAN的算法與U-Net具有相似的相關性和Bland-Altman分析結果，但精確度比U-Net更高。

Salahuddin等[34]針對CCM圖像中像素分布不均衡造成的自動分割中神經顯微結果靈敏度低的問題，在圖像上評估深度學習網絡U-Net中3個不同參數的損失函數，并對結果進行了討論。分析觀察到，Tversky損失函數的最佳訓練時間和收斂時間比二進制交叉熵(binary cross entropy)和Dice損失函數好。這有助于更快獲得更好的結果，意味著診斷效率的提高。

Kucharski等[35]提出了一種基于分水嶺算法的角膜內皮細胞標記驅動分割方法和基于滑動窗口訓練的編碼-解碼卷積神經網絡，用于預測細胞中心(標記)和細胞邊界的概率。該研究利用預測標記對神經網絡輸出的邊緣概率圖進行分水嶺分割，重點研究了3種卷積神經網絡模型(U-Net、SegNet和W-Net)的分割性能，結果顯示該方法的細胞檢測準確度為97.72%。

Mou等[36]提出了一種新的曲線結構分割網絡(CS-Net)，其在編碼和解碼器中引入了一種自注意機制以學習曲線結構豐富的層次表示。該研究利用空間注意力和通道注意力兩類注意力模塊，增強類間辨別和類內響應能力，進一步自適應地將局部特征與其全局依賴性和規范化相結合，并將二維注意力機制擴展至三維，以增強網絡在不同層之間聚集深度信息的能力。實驗結果表明，該方法在多種度量指標上均優于其他最新算法。

Wei等[37]采用基于深度學習算法的卷積神經網絡建立了角膜基底下神經分割網絡。該研究對CNS網絡進行了552次訓練，并在北京大學第三醫院收集的139份IVCM圖像上進行了測試，圖像由3名資深眼科醫生標記，然后形成分割標準答案。該模型的AUC為0.96(95% CI：0.935～0.983)，精度為94%，最小dice系數損失為0.12。分割任務的靈敏度為96%，特異度為75%，CNFL評估任務的相對偏差率為16%。

現有的CCM圖像神經纖維自動檢測方法雖可對部分神經纖維做到基本有效的分割，但仍然存在神經纖維分割結果連貫性差、部分小神經纖維/低對比度神經纖維分支無法正確檢測的問題，從而影響神經纖維參數的計算結果。基于深度學習的CCM神經纖維自動分割方法的結果優于傳統圖像處理和機器學習方法，但目前基于深度學習的CCM神經纖維自動分割方法研究相對較少，如何針對CCM圖像的自身特點進行深度學習模型的優化仍然需要進一步研究。

6 小結

CCM可作為早期神經病變的可重復、無創檢查手段。通過CCM檢查不僅可評估DPN的嚴重程度，還可實現DPN早期預測和診斷，從而提早干預，延緩DPN的進展，提高糖尿病患者的生活質量。但采用角膜神經參數評估DPN目前仍存在局限性，基于人工智能的角膜神經纖維醫學指標提取算法是檢測DPN的一種客觀、可復現的手段，但現有的CCM圖像神經纖維自動檢測方法仍然有較大提升空間，未來應充分挖掘CCM圖像的自身特點以及基于深度學習的CCM神經纖維自動分割方法，以進一步拓展CCM在糖尿病神經病變中的臨床應用。

作者貢獻：吳俊、費思佳共同查閱文獻，撰寫初稿并修訂論文；沈博、張瀚文、黃劍鋒、趙建春、丁大勇提出修改建議；潘琦負責終審校對。

利益沖突：無