誘導性多能干細胞移植治療帕金森病的研究進展

姚盼盼 周斌杰 余勤*

帕金森病（PD）又名震顫麻痹，是一種多發于中老年人群的神經系統變性疾病［1］。目前研究認為，PD發病機制為腦內黑質紋狀體病變，導致多巴胺能神經元（DN）變性死亡，釋放的多巴胺（DA）含量降低，從而使患者運動不能。但引起黑質紋狀體病變的原因仍不明確。誘導性多能干細胞（iPSCs）是指利用載體將特定的轉錄因子轉染已分化成熟的體細胞，通過重編程技術將其誘導成為具有胚胎干細胞（ESCs）特性的多潛能性干細胞［2］。近年來，iPSCs在神經系統疾病、心血管疾病等方面的作用日益凸顯，iPSCs已在體外被成功分化為神經干細胞、心血管細胞和原始生殖細胞等［3-5］，其在臨床疾病的治療中顯現出巨大的潛能與應用價值。

1 帕金森病臨床治療現狀

PD是僅次于阿爾茨海默病的第二大常見慢性神經退行性疾病，目前臨床主要治療手段包括藥物治療、手術治療、基因治療，及康復訓練等［6-7］。由于該病發病機制與致病因素尚不明確，所有的治療均只能改善患者的生活與工作質量，并不能阻止疾病的發展，結局即患者喪失生活能力。因此，繼續尋找有效的治療方法對PD具有重要意義。

1.1 藥物治療 作為治療PD的首選方案。目前，治療運動癥狀的藥物有兩類，一為增強多巴胺能作用的藥物，多巴胺受體激動劑或多巴脫羧酶抑制劑，如鹽酸普拉克索、吡貝地爾緩釋片、卡左雙多巴控釋片、恩他卡朋片等；另一類為抗膽堿能藥物，如鹽酸苯海索等。由于通常需要聯合用藥并長期服藥以控制癥狀，因此易出現藥效減退、“異動癥”等［8］。

1.2 手術治療 當藥物治療出現劑末現象時，患者可以選擇手術治療。手術治療PD的方法主要有兩種，即神經核團毀損術和腦深部電刺激手術（DBS）。神經核團毀損術，可根據病征的不同選擇不同的靶點進行手術，其關鍵在于靶點的精確定位以及毀損灶大小的制作，但靶點定位受多種因素影響，術后易出現多種嚴重并發癥，且易復發［9］，因此已逐漸被DBS所替代。目前，DBS已在國內外廣泛應用，該手術對腦組織結構破壞極小，屬于微創手術，具有可逆性和可調節性，但腦起搏器價格較為昂貴，需要在腦內永久性植入，存在移位和顱內感染的風險［10-12］。

1.3 基因治療 通過將目的基因導入相關腦區來影響特異性蛋白質的表達，以期延緩多巴胺能神經元的丟失或糾正神經遞質失衡［13］。LRRK2、PARKIN、PINK1、GBA等基因被認為與PD發病直接相關［14］，近年來有多項臨床研究嘗試通過立體定向手術導入靶基因，從保護多巴胺能神經元、提高多巴胺遞質、拮抗抑制性神經遞質等不同角度治療PD［15］。目前的基因療法尚需開顱將病毒載體注射到患者大腦中［16］，術后易出現頭痛、腦水腫、惡心等并發癥［17-19］，故治療方法并不適用早期PD患者。因此，改善基因療法的施藥方法，降低其侵入性，是今后研發的重要方向。

2 誘導性多能干細胞與帕金森病

早期的細胞療法中，治療中樞神經系統疾病是將神經干細胞誘導分化成特異性神經細胞，然后移植到大腦受損區域，可在一定程度上改善該區域神經損傷所造成的功能障礙［20］。但成體神經干細胞來源十分稀少，分離與體外培養均較為困難，從而限制了該項技術的應用。此外，ESCs由于具有無限增殖、自我更新和多向分化的特性，一度被認為是細胞移植治療的理想來源，但獲取人類ESCs（hESCs）需破壞胚胎，因其違反道德倫理引發巨大爭議，進而嚴重影響ESCs的研究發展。iPSCs來源于患者自身，成為研究多種疾病的有效細胞替代來源，并可以消除免疫排斥的風險，滿足免疫抑制治療的需要。iPSCs與hESCs不同，該類細胞不受道德倫理等問題的約束，且細胞來源豐富，在未來臨床應用上極具優勢。

2.1 iPSCs治療PD的研究進展 細胞移植治療若要進入PD臨床應用，一個現成的、具有自我更新潛力的細胞來源是必不可少的，并且需具備在移植后分化為DN的潛力。如果DN可以在體外通過干細胞分化由非多巴胺能細胞來源產生，隨后移植到大腦，在紋狀體中調節DA的釋放水平，則有望限制PD 患者的疾病進程，并幫助其恢復運動功能。早在2009年，CHAMBERS等［21］就已獲得hiPSCs衍生的中腦DN，并證實其功能與hESCs來源的DN相似。要制備可移植的mDA細胞來源，關鍵在于確定細胞體外分化的最佳階段。利用hESCs衍生的DN已對其移植最佳階段進行了充分研究。BJORKLUND等［22］將少量早期未分化的hESCs植入大鼠體內，功能性DN自發發育，顯著恢復6-OHDA損傷大鼠的行為，但也可能導致畸胎瘤的形成。HEDLUND等［23］將晚期完全分化的hESCs植入大鼠體內，純化的DN可以避免形成畸胎瘤，但移植后存活率極低。MOON等［24］研究表明，“中間階段”如DN祖細胞相對于完全分化的細胞，可能是一個更優來源。

DOI等［25-26］通過CORIN或LRTM1進行FACS流式細胞術分選hiPSCs衍生的DN祖細胞，移植給6-OHDA損傷的大鼠后，顯著改善其運動行為，并且未形成畸胎瘤。通過測試來自健康個體或PD患者iPSCs衍生的CORIN分選DN祖細胞的存活率和功能，發現DN祖細胞可以改善臨床前6-OHDA缺陷大鼠模型的運動功能障礙［27］。KIKUCHI等［28］的臨床前試驗顯示，hiPSCs來源的DN移植到MPTP處理的食蟹獼猴PD模型后，可以控制癥狀長達2年，具有顯著療效且無畸胎瘤形成，進一步證實了基于iPSCs自體細胞治療PD的潛力。2018年《Nature》［29］報道，全球首個iPSCs治療PD的臨床試驗獲批，Takahashi及其團隊將使用iPSCs培養成的神經前體細胞移植到PD患者大腦中，以期移植的細胞發育成神經元并釋放多巴胺，并將檢測iPSCs治療PD的有效性和安全性。

2.2 iPSCs臨床應用面臨的問題與挑戰 （1）安全性：iPSCs的產生涉及兩個主要過程：一是將編碼重編程因子的載體遞送至靶細胞，二是重編程因子的強制表達。雖然多年來重編程因子幾乎沒有變化，但是基因轉入技術已經取得了重大進展。最初的重編程方案使用逆轉錄病毒或慢病毒作為載體，通過四個外源轉錄因子誘導體細胞重編程，其中包括原癌基因c-Myc。雖然這些基于病毒的iPSCs已用于疾病機制研究，但被認為不適合臨床應用，因為整合的病毒序列可使多種染色體產生畸變，可能導致遺傳功能障礙或腫瘤的形成［30-31］，從而給移植后的患者帶來潛在、不可預估的安全風險。因此，基于iPSCs的細胞療法若要成為臨床可行策略，必須建立安全有效機制，從可移植細胞群中去除任何可能保留形成畸胎瘤潛力的殘余未分化細胞。DOI等［32］已研究評估臨床級hiPSCs系衍生的DN祖細胞的安全性和有效性，并正在進行PD臨床試驗。（2）誘導分化效率低：雖然近年來已有研究使用非慢病毒整合型載體、其他重編程因子，及多種基因轉入方法來誘導iPSCs分化為DN，并取得一定實質性進展，但產生的仍是DN和其他非典型的細胞類型混合物［33-36］，存在誘導分化效率低的問題，可能會給移植后患者帶來不可預估的安全風險。因此，若想獲得足夠數量、高質量、可用于臨床移植治療等級的DN來治療PD，還需提升體外誘導iPSCs細胞定向分化的精確性及高效性。（3）細胞制備技術：不同實驗室對iPSCs誘導分化的方法和結果有一定差異，一旦在動物模型中驗證和優化了可移植細胞來源，還必須解決與細胞制備和處理相關的技術問題。因此，移植前規范的細胞制備流程、可擴增性、冷凍和解凍的穩定性等問題仍需進一步研究。已有研究發現衍生自小鼠和人多能細胞的DN祖細胞可擴增，并且能夠在不喪失功能的情況下經歷冷凍和解凍［37-38］。

3 展望

隨著全球逐步進入老齡化社會，PD患者人數正在急劇上升［39］。PD發病機制復雜，與遺傳、年齡、環境等諸多因素相關［40］，是一種慢性、高特異性的老年疾病，目前其臨床治療仍存在較大難度，無法達到根本治愈。因此，尋找更加有效的治療方案是未來研究PD的重要方向。iPSCs的出現為多種復雜疾病的治療帶來了一道曙光。近年來，眾多研究者采用各種方法對iPSCs進行誘導，以使其在多種疾病中發揮細胞替代作用。2017年，MANDAI等［41］報道了第一例通過移植一片源自異體iPSCs的視網膜色素上皮細胞治療年齡相關黃斑變性的患者，術后1年未出現任何不良反應，并且治療眼睛的敏銳度非常穩定，強烈支持基于自體iPSCs療法在未來臨床應用的可行性。目前，盡管臨床應用iPSCs治療神經系統疾病仍處于探索階段，但就該技術發展的穩定性、倫理和法律問題、免疫原性及可行性而言，相信在不久的未來，基于iPSCs的細胞療法必將應用于臨床，為人類疾病的治療帶來新希望。