VX2兔肝癌原位模型與肝動脈介入放射性栓塞微球方法的建立及輻射防護策略

王志鵬,尹晶晶,許文黎,孫鴿,高潔,張偉,秦秀軍,李建國,劉歡

(中國輻射防護研究院藥物安全性評價中心，太原，030006)

原發性肝癌(PLC)是一種最常見的惡性腫瘤，我國每年有約13萬人死于原發性肝癌[1]。目前肝癌的臨床治療主要包括手術切除、放療、化療、靶向治療等。近年來，放療栓塞治療(TARE)，因其能夠將放射性藥物精準栓塞于腫瘤部位，成為臨床應用研究的熱點[2]。但是相關療法和藥物的研發，需要類似人肝癌轉移的動物模型和相關介入療法的臨床前試驗來驗證其安全性和有效性。VX2兔肝癌原位模型是迄今為止唯一能夠在較大動物建立的肝轉移性腫瘤模型，該模型多用于肝臟腫瘤的影像學和治療學研究[3-6]。該模型腫瘤發展過程與人肝癌相似，是最理想的肝癌實驗模型，在該模型上開發出的藥物和療法對指導臨床選擇腫瘤治療方案有重大意義。目前臨床上介入手術相當成熟，且主要集中于栓塞治療，但目前我國仍然沒有TARE相關藥物，缺乏TARE臨床經驗，因此對于VX2兔肝癌原位模型進行TARE的方法建立尤為重要，能夠為臨床治療提供重要參考價值[7]。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔8只，雌雄各半；5～6月齡，北京市昌揚西山養殖場 SCXK(京)2016-0007；兔VX2肝癌瘤塊來源于東南大學；實驗動物飼養于中國輻射防護研究院放射性實驗動物設施普通環境，單籠飼養SYXK(晉)2019-0002，輻射安全許可證號：國環輻證(00346)。

1.2 主要儀器和試劑

鹽酸利多卡因注射液，山東華魯制藥有限公司；眼科剪，揚州市華宏醫療器械有限公司；GE Light Speed 64層螺旋CT掃描儀，美國 GE公司；碘帕醇注射液，上海博萊科信誼藥業有限責任公司；肝素鈉注射液，天津生物化學制藥有限公司；DSA，美國 GE公司。放射性90Y微球，按照全肝吸收劑量100 Gy進行給藥，90Y為理想的治療用放射性核素，半衰期為64 h，釋放純β輻射(2.288 MeV)。目前上市的90Y 微球主要有90Y-玻璃微球和90Y-樹脂微球，臨床用于治療晚期肝癌，給藥途徑為肝動脈介入給藥[8]。

2 實驗方法

2.1 兔VX2肝癌模型建立

將瘤塊于37 ℃下解凍，先將瘤塊上的壞死組織和肌肉組織去除，然后將瘤塊上的魚肉樣組織剪碎成大小約為1～2 mm3小塊，將其浸泡在無菌鹽水中，用注射器抽取瘤塊。

采用開腹直視下瘤組織塊穿刺注入法接種。實驗兔接種前12小時禁食但不禁水，術前給予兔戊巴比妥鈉麻醉，在以標準外科方式準備和覆蓋腹部后，用小刀片做垂直方向的劍突下小切口，并使用鈍性剝離通過無血管白線暴露腹膜，仔細劃分腹膜可以看到肝臟，逐層入腹，暴露肝臟下緣。使用擴開器將切口擴開，動作溫和的將暴露肝臟內側段和外側段拉出體外，注意避免肝包膜撕裂，暴露的器官應用濕紗布保持濕潤。將含有瘤塊的注射器換用18G穿刺針斜穿刺入肝左葉，注射瘤塊混合液0.1 mL，隨后迅速拔出穿刺針，穿刺點滲出的少量血用無菌棉簽壓迫止血。將肝臟左頁放回體內后，逐層縫合腹膜、肌肉、皮膚。縫合后在皮膚創口處涂撒少量注射青霉素粉針劑。術后連續4天在實驗兔大腿外側肌群注射青霉素，并用碘伏擦拭手術創口來預防感染。

2.2 CT腫瘤觀察

接種后14天，將動物麻醉后置于螺旋CT下進行胸腹部掃描。CT參數為管電壓 80 kV，管電流 60 mA。先平掃定位，后序貫動態三期增強掃描，采集時間分別為動脈期(15 s)、靜脈期(25 s)和延遲期(45 s)。

2.3 VX2兔肝癌原位模型介入給予放射性微球

隨機選取4只動物開展介入給予放射性微球試驗。將模型兔麻醉后，平躺體位將四肢拉直，將動物固定于手術臺，先用手觸摸找出股動脈位置，再用手術刀逐層切開皮膚，分離出股動脈；用穿刺針穿刺股動脈，并置入5F動脈鞘后立即插入2.7F微導管避免動物失血，用手術縫合線將血管鞘與股動脈結扎固定。操作導絲末端手柄將導管導絲送至肝總動脈。于DSA儀器下進行碘帕醇注射液造影，確認微導管位置是否在肝總動脈，并確認附近血管走形找出肝固有動脈的位置；之后繼續操作微導絲上行至肝固有動脈，進行碘帕醇注射液造影，確認肝臟輪廓和腫瘤輪廓。

上述操作確認微導管行至肝固有動脈后，將導管位置固定，使用三通連接器連接裝有放射性微球的注射器、裝有生理鹽水的注射器和微導管，緩慢推注給藥。裝有放射性微球的注射器裝入注射器鉛防護套。給藥后用三通連接器連接的生理鹽水沖洗微導管。給藥后再次使用碘帕醇注射液造影，觀察肝臟和腫瘤血管栓塞情況。上述操作結束后拔出微導管和血管鞘，將股動脈穿刺位置前后1 cm處結扎，結扎股動脈穿刺位置，逐層縫合肌肉、皮膚。縫合后在皮膚創口處涂撒少量注射青霉素粉針劑。術后連續4天在實驗兔大腿外側肌群注射青霉素，并用碘伏擦拭手術創口來預防感染。

3 結果

3.1 VX2兔肝癌原位模型構建及生長情況

動物接種試驗后，有3只動物出現傷口發炎情況，14天后CT檢查時可見所有動物肝臟部位均有低密度結節，判斷為腫瘤，腫瘤平均直徑為1.2 cm。CT結果表明，VX2兔肝癌原位模型構建成功，且成功率達100%。

未進行介入給予放射性微球的4只荷瘤兔于瘤塊種植后30天解剖檢查，可見肝臟腫瘤接種部位有直徑較大的實質腫物，同葉肝臟有多處轉移灶，在肝臟網膜、腹壁開腹部位、肺臟可見多處轉移病灶。結果表明，本實驗所用方法構建的VX2兔肝癌原位模型成功，且成功率達100%，未見動物因感染和手術因素死亡。

3.2 VX2兔肝癌原位模型介入給予放射性微球

VX2兔肝癌原位模型腫瘤為富血管瘤，經DSA下造影檢查，可見肝臟部位清晰的腫瘤輪廓為球狀，且其中血管極其豐富。在肝總動脈入口進行碘帕醇造影，可見在腹腔干動脈上的主要血管走形，在分支中較細的一支行向左下為脾動脈，胃左和肝總動脈共行一段，之后胃左動脈行于胃小彎，肝總動脈向右上走行；肝總動脈之后分出胃十二指腸動脈和肝固有動脈，微導管行至此肝固有動脈(即供養肝臟腫瘤的血管)，再次使用碘帕醇造影檢查，可見血管顯象出肝臟輪廓，且腫瘤清晰可見，將導管位置固定后使用三通連接器連接裝有放射性藥物的注射器、裝有生理鹽水的注射器和微導管，緩慢推注給藥。給藥后再次造影，可以看到之前清晰的腫瘤輪廓變成只有外周一圈的輪廓，內部不可見豐富的血管，表明藥物進入腫瘤組織，且將腫瘤內部血管栓塞，表明給藥成功。

將試驗動物于給藥后16天解剖檢查，可見動物肝臟腫瘤接種位置有直徑較大實質腫物，但同葉肝臟、肺臟均無轉移灶，在肝臟網膜可見少許轉移病灶。

4 放射微球介入試驗操作中的輻射防護策略

因為藥物具有放射性且DSA機器亦通過釋放X射線進行顯像，因此在整個給藥過程中操作人員的受照劑量會很高，在相關操作中應注意人員防護，采取屏蔽防護、時間防護、距離防護相結合的方式，最大可能保護操作人員。

屏蔽防護：在DSA機器球管與介入手術操作人員之間增加10 mm的鉛防護，在動物固定臺于動物下腹部部位增加3 mm的鉛防護，人員穿戴鉛防護服(0.5 mm Pb)，穿戴鉛防護手套(0.02 mm Pb)，佩戴鉛眼鏡(0.5 mm Pb)。

時間防護：熱藥試驗前先進行冷藥的模擬試驗，使各崗位人員能熟練操作縮短操作時間，熱藥試驗時將各個環節分解為流水線操作，保證人員接觸放射性藥物時間最短化，在介入手術和給藥環節進行人員輪崗工作，每人一只。

距離防護：人員在給藥后進行縫合、清創、觀察、清潔等操作時進行鉛簾(0.5 mm Pb)屏蔽，并保持一定距離，飼養期間動物個體之間保持大于2 m的距離。上述試驗的注意事項以及相關防護措施能夠為我國非臨床TARE的相關藥效學和毒理學試驗操作提供一些經驗和建議。

5 討論

為了確保VX2兔肝癌原位模型成功建立，需要注意以下幾點：(1)選取靠近腫瘤邊緣生長旺盛的質嫩灰白色魚肉樣組織進行移植，能夠相應的提高腫瘤細胞的成活率；(2)建模前對動物進行禁食，可以減小實驗動物的腸道返流，避免不必要的不良反應；(3)于肝左葉進行腫瘤組織植入，肝左葉血液豐富體積較大，有利于腫瘤組織生長。

肝動脈介入試驗操作中需要注意：(1)為減小試驗人員受照劑量，采取雙人配合操作，需先進行模擬訓練，提高配合默契度，提高操作成功率；(2)造影找到肝固有動脈后，盡量繼續上行導絲導管至肝左動脈，使藥物能夠更好的富集于肝左葉腫瘤部位，但是在繼續上行過程中需要極其緩慢小心，肝左動脈很細小稍有不慎就會引起血管破裂。

放射微球藥物給藥時注意：采用三通連接器，盡量減少不必要的污染，在微球給藥時應將微導固定，避免位移，之后需要將抽好藥量的注射器進行稀釋，避免濃度較大的微球堵塞微導管，在給藥后用適量生理鹽水沖洗導管，將微導管內的殘留要物沖洗到肝臟；

放射性藥物介入操作和放射性微球給藥操作中的輻射防護策略，可以用于其他放射性藥物的非臨床研究中。