Tim-3在腫瘤中的免疫研究進展

王寒黎，汪向海，秦立龍，汪麗靜

(皖南醫學院第一附屬醫院 呼吸與危重癥醫學科，安徽 蕪湖 241000)

0 引言

肺癌目前仍是全球發病以及死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]，免疫治療已成為部分肺癌病人新的選擇治療手段。而同時免疫檢查點也成為了熱門研究對象。Tim-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-3)是由Havcr2編碼的一種含有T細胞免疫球蛋白和粘蛋白域3的細胞表面分子，最初被發現作為干擾素(IFNγ)特異性的細胞表面標記物，調節CD4+Th1(T helper 1-Th1)和CD8+Tc1(T cytotoxic-Tc1)[2]，后發現在調節性T細胞(Treg)、自然殺傷細胞(NK)、樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞中有所表達等[3][4]。Tim基因家族在鼠11號染色體中有8種(Tim1-Tim8)，而人類染色體5q33.2只有3種(Tim1，Tim3-4)[5]。兩項研究表明[6][7]過度激活的T細胞和髓細胞導致淋巴細胞增生癥及T細胞淋巴瘤，這兩種疾病與Havcr2突變相關，Tim-3作為負性調節因子或者免疫檢查點。免疫反應需要T細胞表面共刺激物質和呈遞細胞(APC)表面的共刺激物質互相作用，Tim-3和PD-1(programmed death -1，PD-1)單抗是其重要的負性調節因子，抑制CD8+T細胞分泌TNF-γ和IL-2，最終抑制T細胞免疫反應[8][9]。研究發現Tim-3在多種腫瘤細胞如白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胃癌等都有表達，且Tim-3與免疫疾病及腫瘤息息相關[10-12]。

1 Tim-3結構與T細胞

Tim家族是具有一定相似結構的Ⅰ型膜蛋白，包括可變的免疫球蛋白V區、不同長度的糖基化粘蛋白區和跨膜區[13]。除了Tim-4外Tim家族都含有酪氨酸信號的胞質尾區。Tim-3信號傳導過程中，Tim-3胞質尾區的酪氨酸Y256和Y263與HLA-B相關轉錄物3(HLA-Bat3，B-associated transcript 3)[14]和SH2(Src homology 2)相互作用，與淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶(Lck，Lymphocytespecific protein tyrosine kinase)以活性催化的作用形式結合。Lck磷酸化形成TCR(T Cell receptor)復合物，隨后Zeta鏈相關蛋白激酶(ZAP70)聚集到TCR復合物中，激活ZAP70、LAT(Linker for Activation of T cells)、PLCγ1 (Phospholipase C gamma 1)及Ca2+從而促進T細胞增殖。然而Tim-3配體如半乳糖凝聚集素-9(galectin-9)[15]和癌胚抗原相關細胞黏附分子-1(carcinoembyronic antigen-related cell adhesion molecule-1，CEACAM1)[16]通過酪氨酸激酶白介素-2誘導的T細胞激酶促發Y256和Y263磷酸化，導致Bat3釋放，ZAP70、LAT、PLC的下調，抑制T細胞增殖。

CD8+T細胞是腫瘤清除的關鍵介質，腫瘤微環境(TMETumor microenvironment)中慢性激活抑制信號時使CD8+T細胞處于功能障礙或衰竭的狀態。失活的T細胞促進產生促炎細胞因子，以及一些檢查點受體的高表達。值得注意的是，Tim-3標志著CD8+T細胞功能失調的亞群。盡管Tim-3導致CD8+T細胞功能紊亂的確切機制尚不清楚，但推測Tim-3可能導致CD8+T細胞功能紊亂[17][18]。Tim-3通過拮抗轉錄因子TCF-1降低CD8+T細胞的干細胞數[19]，而TCF-1是維持干細胞和抑制效應細胞分化的重要因子，與PD-1不同，Tim-3的表達與TCF-1的表達呈負相關[20]。

鑒于黑色素瘤患者的TCF-1+CD8+T細胞與檢查點阻斷免疫治療的反應呈正相關[21]，在臨床前癌癥模型中，Tim-3和TCF-1之間的潛在調節關系具有臨床相關性，即CD8+T細胞中TCF-1+的缺失限制了對檢查點阻斷的反應，Tim-3表達為陰性[22][23]。在腫瘤淋巴結、脾臟或血液中的Treg中，Tim-3在人類和小鼠腫瘤中的CD4+調節性T細胞(Treg)表達水平更高[24][25]。重要的是，Tim-3+Treg表現出更具抑制性的表型[26]。然而Tim-3信號如何影響TME中CD8+T細胞和T細胞的功能表型尚不完全清楚，研究將需要使用譜系特異性突變小鼠進一步探究。

此外，一項研究報道[27]，在肝細胞癌患者功能失調的CD8+T細胞中，結合Tim-3的長非編碼RNA(long-noncoding RNA that binds Tim-3，Lnc-Tim-3)的表達上調，Lnc-Tim-3與Tim-3的結合導致Bat3的釋放，從而降低T細胞的活化。

2 Tim-3與樹突狀細胞

在樹突狀細胞(DC,dendritic cell)-Tim-3信號轉導模型中，HMGB1(high-mobility group protein B1)可單獨與多種受體相互作用，也可與DNA或脂多糖復合。HMGB1受體包括活化糖基化終產物受體(Receptor for Activated Glycation End products，RAGE)、TLR4、TLR2和IL-1R。HMGB1-DNA復合物與RAGE結合，導致內涵體中TLR9和TLR7被激活，引起一些下游轉錄因子的激活，如活化B細胞的核因子-κ輕鏈增強子(NF-κB，Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)、腫瘤相關DC的活化。Tim-3可阻斷HMGB1從而抑制NF-κB介導的DC活化。同時Tim-3與DC的結合激活Btk(Bruton’s tyrosine kinase)和c-Src，這也抑制NF-κB的激活。Tim-3介導的DC抑制CXCL9的產生，從而減少CD8+T細胞向腫瘤微環境的聚集，達到抗腫瘤的目的[28]。

3 Tim-3配體

3.1 Galectin-9

Galectin-9是一種36kDaβ-d-半乳糖苷C型凝集素，為Tim-3的第一個配體。Galectin-9是一種分泌性蛋白，與小鼠Tim-3的IgV結構域上的某種碳水化合物結合，該結構域具有兩個N-連接的糖基化位點[29]。Galectin-9在T淋巴細胞、DC細胞以及自然殺傷細胞NK細胞都有較高的表達，且共同參與合并及其表達[30]。Galectin-9與T細胞表面TIM-3結合，可能類似PD-1產生負性調節刺激[31]，誘導T細胞衰竭，逃避免疫監控而產生免疫逃逸。Tim-3缺乏只減少了galectin-9介導的Th1細胞40%死亡[29]，這表明galectin-9體內給藥的一些效應可能是由galectin-9與Tim-3以外的受體結合介導的。事實上，galectin-9也被報道通過與CD44和IgE的相互作用發揮多種生物學功能[32][33]。體外研究乳腺癌細胞中Galectin-9通過促進癌細胞聚集來抑制轉移潛能，從而限制腫瘤的侵襲及與血管內皮細胞的結合，也有報道證明其能誘導細胞凋亡和抑制肝癌的生長[34]。Galectin-9在腫瘤免疫中的負性調節作用在癌癥患者中的預后價值并不明確。另一方面，有研究表明泌尿系統腫瘤[35]和非小細胞肺癌[36]患者中galectin-9高表達預測了更差的臨床預后。我們需要更多的臨床研究來證明galectin-9機制及預測價值。

3.2 PtdSer

磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PtdSer)是一種凋亡細胞表面帶負電荷的磷脂，大腦細胞為主，是Tim家族成員的配體[37]。盡管Tim-3結合PtdSer的親和力比其他Tim家族成員至少低5倍，但已經證實Tim-3-PtdSer相互作用對體內清除凋亡細胞很重要，抗Tim-3抗體治療的小鼠脾濾泡中凋亡細胞數量有所增加，而血抗dsDNA抗體水平升高[38]。

Tim-3與PtdSer的相互作用在癌癥中的作用尚不清楚，特別是考慮到TME中PtdSer由于多種因素對癌細胞的暴露增加，包括氧化應激和化療、放療的影響[39]。Tim-3-PtdSer相互作用可能在介導Tim-3表達的CD8+dc吞噬凋亡細胞以及隨后凋亡細胞相關抗原交叉呈遞到CD8+T細胞中起重要作用[40]。此外，已有研究表明，B16黑色素瘤細胞在外表面產生表達PtdSer的微泡，并能促進腫瘤生長轉移[41]。Tim-3在這一機制中的作用尚不清楚，需要進一步研究探討。

3.3 HMGB1

HMGB1(高遷移率家族蛋白1-high-mobility group protein B1)是一種由215個氨基酸殘基的染色質蛋白，被報道作為Tim-3的配體，由A-box、B-box和羧基末端構成[42]。HMGB1可由腫瘤細胞和其他細胞分泌，可單獨作用，也可與DNA或脂多糖復合物相互作用。HMGB1受體包括RAGE、TLR4、TLR2和IL-1[43]。HMGB1-DNA復合物與RAGE結合，導致位于內體的TLR9和TLR7的內化和激活。這種相互作用可以刺激促炎癥和免疫刺激途徑。TIM-3結合其A-box結構域后，抑制核酸及HMGBl功能、阻礙Toll樣受體和體內固有免疫應答[44]。

在小鼠癌癥模型中，Chiba等人[45]表明，DC細胞上Tim-3作為HMGB1的分子陷阱，從而抑制核酸進入內質體，抑制TME中DC的激活。因此，他們發現Tim-3阻斷劑可以提高順鉑化療的反應效率，而順鉑可以增加人宮頸癌細胞[46]和結腸癌細胞[47]中HMGB1的表達。Tim-3-PtdSer和Tim-3-HMGB1相互作用在調節對不同化療藥物的反應中的相對作用仍有待確定。

3.4 CEACAM1

癌胚抗原相關細胞黏附分子-1(carcinoembyronic antigenrelated cell adhesion molecule-1，CEACAM1)在活化T細胞上高水平表達，同時在DC、單核細胞、巨噬細胞和黑色素瘤等腫瘤細胞表達。CEACAM1能在細胞內外結合Tim-3，也是Tim-3的配體之一。細胞內結合對Tim-3蛋白的成熟起重要作用。在小鼠結腸炎模型中，CEACAM1 高表達的T細胞使其Tim-3水平降低，伴隨著效應細胞因子IFN-γ、IFN-α、IL-17A的增加。細胞外結合可以刺激Tim-3釋放Bat3，從而允許Tim-3介導的TCR信號抑制[16]。

CEACAM1和Tim-3在TME功能失調的CD8+T細胞上高表達。因此，Tim-3-CEACAM1相互作用可能抑制這些細胞中順式或反式的免疫反應。值得注意的是，CEACAM1已被證明可與自身結合，同時數據顯示，CEACAM1自身相互作用比CEACAM1-TIM-3相互作用更強。盡管還需要進一步的研究來描述CEACAM1-CEACAM1和CEACAM-Tim-3相互作用的生理背景，但已經證明在體內抗Tim-3抗體干擾Tim-3與CEACAM1和PtdSer的結合[48]。

Tim-3可能同時與多個配體結合。Tim-3與PtdSer或CEACAM-1的結合并不排除與Galectin-9的結合，因為結合位點位于Tim-3 IgV結構域的對面。鑒于galectin-9具有兩個相同的碳水化合物識別域，有人提出galectin-9可用于聚集Tim-3-PtdSer或Tim-3-CEACAM1復合物，從而促進Tim-3信號傳導。CEACAM-1、PtdSer或galectin-9的表達是否占優勢可能是Tim-3信號在特定組織中的關鍵決定因素。

4 總結

Tim-3由多種免疫細胞表達，且可以被不同的配體激活，關于Tim-3在TME中介導發揮的生物學效應及其作用機制有待更多的研究探討證實。盡管最初的研究結果表明Tim-3可能作為一種共刺激受體發揮作用，但最近的報告表明，HAVCR2的功能缺失突變導致免疫系統過度激活導致的疾病，從而確立了Tim-3作為一種抑制受體的作用。目前，抗Tim-3抗體的治療潛力正在不同類型的癌癥中進行研究探討，進一步闡明TIM-3的這些關鍵功能將有助于指導臨床開發，為腫瘤免疫治療提供更多的有效選擇。