間充質干細胞外泌體對眼部疾病的治療作用

王亞鵬，李江偉，彭 俊，周亞莎，龍 達，彭清華,

0引言

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群具有多向細胞分化潛能和自我細胞更新的多能干細胞，可從多種組織如胎盤、臍帶、脂肪、骨髓、肌肉和牙髓等中獲取[1]。MSCs具有保護神經系統、多向細胞分化、抑制機體炎癥反應和促進免疫系統調節等多種生物學功能。研究發現MSCs的功能與其旁分泌機制(尤其是外泌體)有著密切的聯系。MSCs來源的外泌體(mesenchymal stem cells-derived exosomes，MSC-Exo)是MSCs旁分泌作用的主要物質，是一種包括信使RNA、微小非編碼RNA(miRNA)、雙層脂質、蛋白質的細胞外囊泡小體，其大小均一，直徑為30～150nm，密度為1.13～1.18g/mL，其傳遞是通過進入細胞內吞泡膜向內凹陷而形成多泡內涵體并與細胞膜融合而釋放[2]，可避免其攜帶的特異蛋白質和mRNA在分泌到細胞外后被迅速吸收降解，從而可在整個細胞外保持穩定的機體生物學活性，到達機體遠端發揮作用，并可長時間保持有效生物學功能[3]。研究表明，MSC-Exo通過傳遞蛋白質和RNA完成細胞間的通訊，可實現介導MSCs的促進修復、保護神經、免疫系統調節等功能[4-5]。MSC-Exo在肝腎肺臟損傷修復，骨骼肌、軟骨、神經組織、口腔組織、心血管再生和皮膚創口愈合等多種疾病中具有重要的治療作用[6]，相比較MSCs而言，外泌體更加穩定，易于修飾，且不具有成瘤性的風險。此外，由于外泌體的納米級尺寸和雙層脂質膜結構，可以很容易地通過人體生物屏障進入靶向免疫器官和細胞發揮治療作用。研究表明，MSC-Exo對各種眼部疾病如干眼、抑制角膜移植排斥反應、視網膜脫離、黃斑變性、青光眼、自身免疫性葡萄膜炎等具有治療潛能[7-8]。現就MCS-Exo在眼部疾病中的作用及臨床應用前景進行討論。

1對干眼的治療作用

干眼(dry eye，DED)是一種以淚膜內穩態喪失為特征的眼表多因素疾病，伴有淚膜穩定性差、淚液高滲性、眼表炎癥等[9]，目前該病的患病率不斷提高，嚴重影響患者的生活質量。國際淚膜和眼表協會(Tear Film and Ocular Surface Society,TFOS)與國際干眼研討會(International Dry Eye Workshop，DEWS)一致認為，淚液高滲性和淚膜不穩定性是DED的核心病因，眾多學者認為DED發生的關鍵因素是淚液滲透壓增高誘導的眼表炎癥。有研究表明，DED患者及動物模型中IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α呈現高表達，這對眼表炎癥的發生及發展具有重要作用，且表達水平與DED的嚴重程度呈正相關。目前，DED無法治愈，目前主要的治療方法為采用人造眼淚、抗炎滴眼液和局部免疫抑制，目的是改善慢性角膜炎癥的癥狀[10]。

前期研究已知MSCs顯示出具有角膜上皮前體細胞的形態特征，可檢測出Integrin D1、Cx43、Pax6和P63等角膜上皮前體細胞的標志，說明適宜條件下MSCs能誘導分化為角膜上皮前體細胞[11]。蔡麗萍等[12]研究發現，在苯扎氯銨誘導的小鼠干眼模型中，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)滴眼組及眼眶注射組均可有效降低眼表炎癥指數、降低熒光素染色評分(corneal fluorescein staining，FLS)、延長淚膜破裂時間(tear break-up time，BUT)、修復角膜上皮，表明其對DED有一定的治療作用。王希蓮等[13]研究發現，靜脈輸注人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)或兔脂肪來源的MSCs能有效緩解兔自身免疫性干眼的病情進展，且在發病前預防性輸注hUC-MSCs能夠取得相似的治療效果，但靜脈輸注MSCs有一定的風險，故臨床應用有局限性。

李娟等[14]用MSC-Exo處理小鼠干眼模型后，進行小鼠淚膜功能相關檢查，包括淚液分泌試驗(SchirmerⅠtest，SⅠt)、BUT、FLS測定，發現MSC-Exo組BUT延長，SⅠt增加，FLS評分降低，組織病理學結果顯示小鼠角結膜中浸潤的炎癥細胞減少，角膜上皮細胞形態更加規整，微絨毛濃密，治療效果明顯。相關研究表明[15]MSC-Exo能夠降低炎癥分子IL-1β、IL-6、TNF-α的轉錄，說明MSC-Exo可以減輕DED小鼠角膜上皮的損傷。

李娜等[16]實驗發現在兔自身免疫性干眼模型的淚腺組織中TNF-α和IL-1β mRNA表達顯著增加，而抗炎因子IL-10 mRNA表達下調，人臍帶間充質干細胞來源外泌體(hUC-MSC-Exo)可誘導外周血中單核巨噬細胞向抗炎性M2表型極化，從而有效促進IL-10、TGF-β分泌，抑制巨噬細胞相關炎性因子如TNF-α和IL-1β分泌，達到抑制炎癥反應的效果。

2對角膜移植排斥反應的免疫抑制作用

角膜病是世界上最常見的與失明相關的眼病之一，是我國第二大致盲眼病，臨床證實其可靠、有效的復明手段為角膜移植手術。正常生理情況下，角膜屬于自體免疫特殊區域，但由于是同種異體移植，移植的角膜可引起移植體內抗原抗體反應，致使角膜植片混濁、功能喪失，甚至失明，從而導致角膜移植失敗[17]。角膜移植后排斥反應是多種細胞(如T、B細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞等)和免疫分子參與的免疫排斥反應[18]。在角膜移植排斥反應的高危患者中，減少或防治角膜排斥反應是提高手術成功率及患者生活質量的關鍵[19]。目前臨床主要用糖皮質激素、環孢素A滴眼液等，但長期使用可誘發青光眼、白內障、肝腎毒性等疾病及不良反應，故優化治療尤為重要。

Jia等[20]前期研究發現，在大鼠結膜下注射MSCs或尾靜脈注射MSCs可抑制炎癥反應和上調Th2細胞因子，在對MSCs進行示蹤觀察后，發現結膜下注射MSCs后72h，結膜囊中存在大量MSCs，但前房以及角膜組織中未見表達，總體效果可延長角膜植片存活時間。賈喆等[21]通過進一步研究發現，比較結膜下注射MSCs和MSC-Exo后角膜植片存活時間，發現24h后結膜囊、角膜組織中以及前房內均可見外泌體的定位表達；72h后發現結膜囊中外泌體存在量極少，最終MSCs-Exo治療組角膜植片的存活時間更長。因此得出結論：MSCs-Exo可以發揮免疫調節作用，能夠調節免疫應答并促進免疫組織修復，抑制T細胞免疫應答、改變Th1/Th2免疫應答平衡以及上調調節性T細胞，可以克服體內生物屏障到達角膜以及前房從而發揮生物學功能，對抑制角膜移植術后細胞排斥反應有一定作用。

3對視網膜細胞及視神經損傷的保護作用

損傷、感染或局部缺血引起的視網膜細胞損傷會觸發鄰近神經細胞的變性，導致視網膜形態和功能的損傷以及不可逆的視力損害[22]。目前干細胞移植、抗炎藥、信號通路抑制劑、神經營養因子等在各種視網膜疾病模型中均顯示出神經保護作用[23]。既往研究證明，靜脈注射MSCs可通過抑制細胞凋亡和炎癥反應來挽救視網膜激光損傷[24]。王寧等[25]通過在大鼠視網膜下移植BMSCs，推測BMSCs的作用機制可能與其分泌細胞因子bFGF而起到營養支持和多向分化的潛在功能有關，其可通過改善視網膜微環境而起到保護光感受器細胞的作用。

Yu等[26]在激光誘導的視網膜損傷小鼠模型中，通過在玻璃體腔注射MSC-Exo，發現視網膜中單核細胞趨化蛋白(MCP-1)明顯下調，熱損傷后的視網膜細胞中的MCP-1 mRNA表達也明顯下調。這些結果表明，玻璃體腔注射MSC-Exo可通過下調MCP-1減少視網膜損傷，抑制細胞凋亡和巨噬細胞浸潤，從而保護視網膜結構和功能。Mead等[27]研究發現，在以視網膜神經節細胞(RGC)死亡和軸突變性為特征的大鼠視神經擠壓(ONC)模型中，BMSC-Exo中的miRNA展現出顯著的神經保護和促進神經再生作用。因而推測，BMSC-Exo可以有效促進視網膜創傷修復，抑制炎癥和免疫，保護視網膜神經功能，具有較好的潛在臨床應用價值。

視網膜脫離(retinal detachment，RD)是視網膜神經上皮層與色素上皮層的物理分離，是最常見的威脅視力的疾病之一。馬明明[28]研究表明，MSC-Exo含有抗炎、神經保護和抗凋亡的蛋白效果，可以減輕RD對光感受器細胞變性的影響，能抑制炎癥因子的產生，增強光感受器細胞的自噬，減少凋亡，發揮保護視網膜的功能[29]，從而對RD誘導的視網膜損傷具有治療作用。

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種多因素的進行性致盲眼病，是50歲以上人群不可逆性視力下降的首要原因[30]。已知脈絡膜新生血管(CNV)是ARMD的主要病理改變，而血管內皮生長因子(VEGF)是促進CNV形成的主要生長因子，其中VEGF-A與眼內新生血管生成密切關聯。何廣輝[31]將hUC-MSC-Exo按照不同作用濃度注射到動物眼球中，通過熒光造影檢查和免疫組織化學染色檢測發現CNV動物模型的滲漏情況較對照組好轉，并下調CNV形成處VEGF-A蛋白的表達，表明hUC-MSC-Exo能夠改善光損傷所致的細胞形態學改變，且與作用濃度和作用時間呈正比。

糖尿病性視網膜病(DR)是老年人視力喪失的主要原因之一，視網膜中炎性細胞因子的增加與DR中的視網膜病變程度密切相關。Zhang等[32]和Liu等[33]研究發現，MSC-Exo中miR-126在調節高血糖誘發的視網膜炎癥因子的表達中起關鍵作用，過表達miR-126的MSC-Exo在糖尿病大鼠中顯著降低了視網膜內皮細胞中高糖誘導的HMGB1表達和NLRP3炎性小體的活性，從而改善了糖尿病大鼠的高血糖誘導的視網膜炎癥。

青光眼(glaucoma)是導致不可逆性失明的一種進行性視神經病變，全世界有超過7 000萬人受到本病的影響[34]。其特征是RGC的逐漸喪失，眼內壓升高(IOP)被認為是導致青光眼RGC凋亡增加的主要原因。Harrell等[35]在青光眼動物模型玻璃體腔注射MSCs后發現，注射后可產生神經營養蛋白和免疫調節因子，可誘導RGC的擴增和再生，提供小梁網完整性，并減輕視網膜炎癥。Mathew等[36]表明MSC-Exo能夠在玻璃體內給藥后至少停留4wk，并且由于其納米尺寸，可能會迅速到達RGC，為它們提供神經營養蛋白，最終達到保護RGC的作用。

4對自身免疫性葡萄膜炎的治療作用

自身免疫性葡萄膜炎是一種涉及葡萄膜和視網膜的自身免疫性疾病，是全世界視力障礙的主要原因，全身或局部給予皮質類固醇聯合免疫抑制藥物是自身免疫性葡萄膜炎的傳統治療方案[22]，但長期使用會有全身性副作用以及白內障和青光眼的風險[37]，因此優選球周/眼內注射藥物治療。Li等[38]既往研究發現，在大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)模型中靜脈輸注大鼠MSCs可以抑制T細胞增生，下調Th1、Th17效應細胞，上調Th2、Treg細胞，能有效預防和治療抗原誘導的EAU發生發展；研究發現在球周注射人來源的MSC-Exo治療大鼠EAU，可顯著抑制病情，保護視網膜。

Bai等[39]發現在EAU大鼠模型局部應用MSC-Exo，可以有效抑制炎癥細胞的遷移，并顯著降低CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+的百分比。這些發現表明，眼周注射MSC-Exo至少部分地通過抑制白細胞遷移而發揮有益作用,且眼周注射人MSC-Exo可通過下調MCP1/CCL21和MYD88依賴性途徑來降低白細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞的浸潤和遷移，減少EAU大鼠的白細胞浸潤，保護視網膜結構并挽救視網膜功能。這些研究的結果表明，MSC-Exo可用于治療人類自身免疫性葡萄膜炎。

5小結

目前，對外泌體的研究熱潮方興未艾，相比于MSCs在多種疾病中的直接治療，MSC-Exo具有毒性小、免疫原性低、靶向歸巢能力強和可包載的物質種類多等特點[40]，因此在使用、轉移過程中更安全；MSC-Exo可通過特定細胞在特定環境下的培養、擴增而獲得，獲得方式更便捷，獲取成本更低，速度更快；同時，MSC-Exo還能夠修飾為特定的特異性細胞分子，更能提高治療效果；MSC-Exo是天然納米囊泡，在藥物遞送載體上具有先天優勢。可見，MSC-Exo在安全性、作用劑量、作用效果方面均優于MSCs，更具有應用前景與價值[41]。但目前對MSC-Exo在眼部疾病中的治療時間、治療量，以及其發揮治療作用的機制仍缺乏全面的認知，對MSC-Exo的探究需進一步的基礎醫學和轉化醫學研究推動發展以及研究者的共同努力。