血小板顆粒釋放機(jī)制及其對標(biāo)本檢驗(yàn)前變異影響研究進(jìn)展

張式鴻， 房邦仁， 葉曼曼， 鄧冠華

（1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510080；2.廣州陽普醫(yī)療科技股份有限公司廣東省醫(yī)用材料血液相容性研究企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510530）

血液標(biāo)本檢驗(yàn)前變異是臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)需要加以注意并控制的重要環(huán)節(jié)。導(dǎo)致血液標(biāo)本檢驗(yàn)前變異因素有很多，其中血小板活化及其內(nèi)容物釋放對血液標(biāo)本的檢測影響很大，一方面可改變血清與血漿成分，另一方面可通過對血細(xì)胞代謝的影響，進(jìn)一步改變血清、血漿及血細(xì)胞原始狀態(tài)，最終影響檢驗(yàn)結(jié)果。了解血小板釋放機(jī)制、調(diào)節(jié)因素及影響因素，能為正確處理標(biāo)本提供理論依據(jù)，指導(dǎo)檢驗(yàn)人員盡可能在檢驗(yàn)前維持標(biāo)本的原始狀態(tài)，最大限度地減少檢驗(yàn)前變異，提升檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文對血小板釋放的機(jī)制和調(diào)節(jié)因素及其與標(biāo)本檢驗(yàn)前變異的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 血小板釋放的物質(zhì)基礎(chǔ)

血小板直徑為1～3 μm，是血液中體積最小的血細(xì)胞，對生理止血、維持毛細(xì)血管通透性、完整性及促進(jìn)凝血等功能的發(fā)揮至關(guān)重要。血小板能執(zhí)行這些功能的關(guān)鍵在于血小板釋放，而胞質(zhì)內(nèi)含有的α顆粒、致密顆粒、溶酶體顆粒是促進(jìn)血小板釋放的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。

血小板胞質(zhì)內(nèi)含有的3種顆粒中，α顆粒含量最多、體積最大[1]。通過透射電鏡中可觀察到α顆粒結(jié)構(gòu)從外向內(nèi)依次是：顆粒外膜、管道支持結(jié)構(gòu)、低電子密度區(qū)和高電子密度類核區(qū)。致密顆粒是血小板中含量第二豐富、體積最小的顆粒，每個(gè)血小板有3～8個(gè)致密顆粒，直徑約為150 nm[2]。溶酶體顆粒體積比α顆粒小，在人體血小板中含量非常低，結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物一般是由單層膜包被的圓形顆粒[3]。

2 血小板釋放的機(jī)制

血小板釋放的具體機(jī)制仍在探索之中，較被認(rèn)可的說法是1993年S?LLNER等[4]在研究神經(jīng)遞質(zhì)分泌機(jī)制過程中提出的膜融合假說，該假說主要由膜融合“引擎”——可溶性N-乙基-馬來酰亞胺敏感因子結(jié)合蛋白受體（soluble N-ethylmaleimide-sensitive attachment protein receptor，SNARE）蛋白介導(dǎo)。但還需其他分子如Sec1/Munc18（SM）蛋白、N-乙基-馬來酰亞胺敏感融合蛋白（N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein，NSF）和可溶性NSF接觸蛋白（soluble NSF attachment protein，SNAP）的協(xié)助才能完成膜融合[4]。SNARE是小分子膜結(jié)合蛋白超家族成員，根據(jù)功能不同可分為囊泡膜SNARE和靶膜SNARE。單體囊泡膜SNARE與靶膜SNARE結(jié)構(gòu)上是未折疊的，雖也能自發(fā)結(jié)合，但這種結(jié)合不穩(wěn)定，需SM蛋白協(xié)助才能形成穩(wěn)定“拉鏈狀”三聯(lián)復(fù)合體，稱為Trans-SNARE復(fù)合體或SNAREpin。該復(fù)合體釋放的大量能量足以克服膜之間的能量和水合力量，實(shí)現(xiàn)膜靶向接觸并發(fā)生融合，然后三聯(lián)復(fù)合體在NSF、SNAP的幫助下發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，形成Sis-SNARE復(fù)合體并很快解體，SNARE重新投入下一個(gè)循環(huán)。

有研究表明，SNARE介導(dǎo)膜融合機(jī)制也是血小板顆粒釋放的主要機(jī)制，并與神經(jīng)遞質(zhì)分泌過程有許多相似之處，如分泌機(jī)制的啟動(dòng)信號(hào)均為細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，細(xì)胞內(nèi)囊泡或顆粒均通過依賴SNARE途徑被“分泌”至細(xì)胞膜外[5]。血小板中囊泡膜SNARE包括囊泡相關(guān)膜蛋白（vesicle-associated membrane protein，VAMP）-2、VAMP-3、VAMP-7和VAMP-8，靶膜SNARE包括syntaxin-2、syntaxin-4、syntaxin-6、syntaxin-7、syntaxin-11、syntaxin-12、syntaxin-16、syntaxin-17和syntaxin-18[6-8]。KOSEOGLU等[9]發(fā)現(xiàn)，VAMP-7主要分布在擴(kuò)張血小板外圍，而VAMP-8主要集中在血小板顆粒區(qū)。BANERJEE等[10]的研究表明，VAMP-3在α顆粒內(nèi)吞途徑中發(fā)揮重要作用，而在血小板胞吐作用中發(fā)揮的作用較小。FENG等[11]在體外利用針對VAMP家族、syntaxin-2、SNAP-23單抗也證明SNARE是血小板顆粒分泌途徑中必不可少的因素。GOLEBIEWSKA等[12]在研究血小板膜融合時(shí)發(fā)現(xiàn)，syntaxin-8缺失與致密顆粒胞吐作用缺陷有關(guān)。

3 血小板釋放的調(diào)節(jié)因素

血小板釋放受多個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)，起主導(dǎo)作用的是膜融合和活化。其中膜融合環(huán)節(jié)中主要是SM蛋白、Rab蛋白、細(xì)胞骨架和膜成分等發(fā)揮主要作用，而血小板表面膜受體、信號(hào)通路相關(guān)分子、鈣結(jié)合類蛋白在活化環(huán)節(jié)中占主導(dǎo)作用。

3.1 膜融合環(huán)節(jié)對血小板釋放的調(diào)節(jié)

3.1.1 SM蛋白的調(diào)節(jié) CARDENAS等[13]在研究SM蛋白在血小板分泌中作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，缺乏Munc18-1和Munc18-3對血小板胞吐作用沒有影響，但Munc18-2缺乏則可完全抑制α顆粒、致密顆粒、溶酶體顆粒釋放，并削弱血小板聚集和體外血栓形成。

3.1.2 Rab蛋白的調(diào)節(jié) 目前在人體血小板中發(fā)現(xiàn)超過40個(gè)Rab蛋白成員[14]，主要通過影響膜融合而調(diào)節(jié)血小板活化及分泌；JALAGADUGULA等[15]的研究結(jié)果顯示，因轉(zhuǎn)錄因子RUNX1缺失而導(dǎo)致Rab1B下調(diào)會(huì)改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基復(fù)合體早期囊泡運(yùn)輸，最終導(dǎo)致α顆粒中血管性血友病因子含量降低。

3.1.3 細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié) 與微絲或微管相關(guān)類蛋白在血小板內(nèi)顆粒物、囊泡釋放或靶向運(yùn)輸?shù)冗^程中發(fā)揮非常重要作用，這類蛋白主要包括微管蛋白、肌動(dòng)蛋白[16-17]等。BEGLEY[16]采用紫杉醇和拉春庫林A分別阻斷凝血酶和驚厥毒素誘導(dǎo)血小板中二磷酸腺苷-核糖基化因子6（adenosine diphosphate-ribosylation factor 6，ARF6）活化后，發(fā)現(xiàn)微管分解和肌動(dòng)蛋白組裝在血小板激活關(guān)鍵信號(hào)因子ARF6的激活中發(fā)揮重要作用。GE等[17]的研究表明，細(xì)胞骨架F-肌動(dòng)蛋白通過物理屏障作用來調(diào)節(jié)血小板致密體分泌。

3.1.4 膜成分的調(diào)節(jié) 磷脂酸等脂膜成分和脂膜代謝產(chǎn)物在S N A R E介導(dǎo)膜融合過程發(fā)揮重要作用，但其中脂膜結(jié)構(gòu)變化的機(jī)制尚不清楚[18-19]。ZHUKOVSKY等[20]的研究結(jié)果顯示，磷脂酸是膜融合過程中酶活化生成的脂質(zhì)底物，且通過生成負(fù)膜曲率、與膜融合所需相關(guān)蛋白的相互作用和激活與膜重排相關(guān)的酶等機(jī)制來影響膜融合。

3.2 活化環(huán)節(jié)對血小板釋放的調(diào)節(jié)

3.2.1 血小板表面膜受體的調(diào)節(jié) 根據(jù)功能不同，血小板表面膜受體主要分為活化受體和黏附受體，前者典型代表有血栓素受體、二磷酸腺苷受體和凝血酶受體，后者主要以膠原受體、糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合體為代表。有研究表明，血小板膜受體并不均勻分布于膜上，而是常聚集于表面的一些被稱為“脂質(zhì)筏”的微小結(jié)構(gòu)域[21]。任何受體結(jié)構(gòu)或功能異常均可導(dǎo)致血小板對刺激信號(hào)不應(yīng)答或應(yīng)答不足從而影響釋放。巨大血小板綜合征[22]是一種先天性出血性疾病，其根本原因是血小板表面GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合體缺失或功能障礙導(dǎo)致血小板聚集功能障礙，致使血小板無法對相應(yīng)刺激信號(hào)，如血管性血友病因子和凝血酶作出有效反應(yīng)。

3.2.2 信號(hào)通路相關(guān)分子的調(diào)節(jié) Ca2+、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸、肌醇三磷酸等[23-24]信號(hào)分子在血小板分泌中發(fā)揮信號(hào)傳遞作用，如這些信號(hào)分子工作異常，信號(hào)傳遞通路可被阻斷進(jìn)而影響血小板功能或行為。

3.2.3 鈣結(jié)合類蛋白的調(diào)節(jié) 血小板釋放會(huì)促進(jìn)血小板內(nèi)鈣離子濃度升高，同樣細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升也會(huì)促進(jìn)血小板分泌顆粒物，鈣結(jié)合類蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平來控制血小板分泌[25]。

4 血小板釋放對標(biāo)本檢驗(yàn)前變異的影響

平均血小板體積是臨床上廣泛應(yīng)用的血常規(guī)指標(biāo)，常用于反映血小板體積大小、預(yù)測凝血活性和血小板活化。有研究表明，血小板聚集增強(qiáng)和黏附分子表達(dá)增加可增大其活力和體積并使其釋放更多的血栓素A2和β血小板球蛋白[26]。外界環(huán)境某些刺激可能改變離體血小板形態(tài)、體積，并使其活化和釋放，而后可能對標(biāo)本檢驗(yàn)前變異造成影響[27-28]。另外，外部剪切力是影響血小板聚集和活化因素之一。LEE等[29]的研究表明，在更大剪切力作用下膠原表面血小板聚集更顯著。DENG等[30]的研究表明，高剪切力作用下血小板激活需通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。RAHMAN等[31]的研究結(jié)果顯示，增大上游剪切力可增強(qiáng)下游血小板活化程度；另外，溫度也會(huì)影響血小板的活化和分泌。HORIOK等[32]用-20 ℃低溫處理小鼠后，發(fā)現(xiàn)低溫可激活脾臟中的血小板，并使其釋放顆粒中的血小板第4因子（platelet factor 4，PF4）和前血小板堿性蛋白。WOOD等[33]的研究表明，低溫存儲(chǔ)后血小板表面膜糖蛋白（GPⅠb、GPⅨ、GPⅡb和GPⅣ）表達(dá)會(huì)下降，而血小板活化標(biāo)志物PF4、P-選擇素表達(dá)會(huì)增加。JOHNSON等[34]的研究表明，與室溫儲(chǔ)存的血小板相比，低溫和冷藏保存的血小板中微顆粒含量明顯升高，且凝血酶生成速度更快。此外，標(biāo)本儲(chǔ)存容器及添加物也會(huì)致使血小板活化，并影響其釋放血小板源性微顆粒、可溶性P-選擇素、血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondin，TSP）。MUSSBACHER等[35]在常溫下采用不同抗凝劑（[檸檬酸-茶堿-腺苷-雙嘧達(dá)莫（citrate-theophylline-adenosinedipyridamole，CTAD）、酸檸檬酸-右旋糖（acid-citrate-dextrose，ACD）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、檸檬酸鹽、肝素）抗凝并分離血漿，監(jiān)測血小板中儲(chǔ)存因子，結(jié)果顯示CTAD和ACD抗凝血漿標(biāo)本常溫儲(chǔ)存6 h內(nèi)，其PF4和TSP-1含量最低、變化最小；他們還發(fā)現(xiàn)在4 ℃條件下制備的血漿標(biāo)本中，CTAD抗凝標(biāo)本中PF4和TSP-1含量在24 h內(nèi)最穩(wěn)定。MANNU?等[36]在研究EDTA、檸檬酸鈉、硫酸鎂抗凝效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，在相同血小板體積范圍內(nèi)，EDTA抗凝血漿標(biāo)本中血小板活化產(chǎn)物P-選擇素表達(dá)最高。呂明恩等[37]研究原發(fā)性血小板減少癥出血患者出血風(fēng)險(xiǎn)與血小板活化相關(guān)性時(shí)，發(fā)現(xiàn)血小板活化前、后α顆粒分泌的P-選擇素的表達(dá)和比值與血小板計(jì)數(shù)顯著相關(guān)。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，血小板釋放反應(yīng)在血小板參與的各種反應(yīng)中占重要地位。體內(nèi)許多因素，如炎癥、肺部疾病、心肌梗死等能導(dǎo)致血小板異常激活而釋放顆粒內(nèi)容物，使血漿環(huán)境里物質(zhì)種類和濃度發(fā)生變化，物質(zhì)代謝、信號(hào)通路等受到干擾，導(dǎo)致機(jī)體止凝血功能改變，并產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀。體外由于儲(chǔ)血材料的介入，血小板激活釋放過程更復(fù)雜。這就意味著，實(shí)驗(yàn)室獲得的看似穩(wěn)定的血清或血漿標(biāo)本實(shí)際上可能并不穩(wěn)定，這樣的標(biāo)本將無法保證檢測項(xiàng)目的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

未來的研究如能詳細(xì)闡明血小板釋放內(nèi)容物在血漿中的代謝機(jī)制及其與其他細(xì)胞或可溶性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的機(jī)制，并建立準(zhǔn)確評(píng)價(jià)血小板釋放的方法和體系，將能為臨床實(shí)驗(yàn)室提供控制檢驗(yàn)前變異因素的理論依據(jù)，為生物醫(yī)用材料血液相容性研究提供新思路，也能為制藥工程研究提供新方向。