外泌體miRNA在膿毒癥中的研究進展

葉榮宗 綜述 鄧烈華 審校

廣東醫科大學附屬醫院重癥醫學科，廣東 湛江 524002

膿毒癥是由于宿主對感染的免疫反應失調而發生的全身炎癥[1]，全球每年約有3 000萬人感染膿毒癥，導致600萬人死亡[2]。目前缺乏快速和可靠檢測方法，因此很難做出準確的診斷。這種不確定性可能導致延遲診斷或過度治療。外泌體是由多囊泡體與細胞膜融合形成的直徑為40～200 nm的細胞外囊泡，主要由蛋白質、脂質和核苷酸等組成，可促進細胞間通訊[3]。膿毒癥期間釋放的外泌體的內容物和功能發生改變，可導致多器官功能障礙。外泌體miRNA在膿毒癥細胞間信息傳遞中發揮重要作用，本文就外泌體miRNA在膿毒癥中研究進展綜述如下：

1 外泌體miRNA參與膿毒癥發病機制

1.1 外泌體miRNA與膿毒癥炎癥反應 在膿毒癥的發病過程中，miRNA在調節適應性和先天免疫應答中發揮著重要作用[4]。一些miRNA，如miR-155、miR-125和miR-146a，在TLR/NF-κB誘導的炎癥級聯負調節和先天免疫中起著至關重要的作用[5]。為了協調免疫細胞的炎癥反應，有效的細胞間通訊是必要的。YΙNG等[6]研究顯示，外泌體中的miRNA是導致生物效應的主要原因。最近，有研究發現在膿毒性休克患者血漿來源外泌體miRNA可能通過炎癥和氧化應激機制誘導血管凋亡和心肌功能障礙[7]。此外，外泌體miRNA可以通過調節不同信號通路中的靶蛋白來調節炎癥。miR-223直接靶向STAT3調節促炎細胞因子。另外，TLR/NF-κB刺激引發的ΙL-6可促進miR-223下調；ΙL-6可以形成促炎細胞因子產生的正調控環[8]。因此，當從骨髓間充質干細胞中提取miR-223的外泌體應用于膿毒癥動物模型時，可下調膿毒癥靶基因的表達，抑制巨噬細胞的炎癥反應。外泌體中均存在可調節炎癥反應的促炎和抗炎miRNA。ALEXANDER等[9]研究顯示，樹突細胞釋放含有miR-155和miR-146a的外泌體，這些外泌體可被其他受體樹突細胞吸收，從而重新編碼細胞對內毒素的反應。miR-155和miR-146a可以在體內免疫細胞之間傳遞，外泌體miR-146a抑制小鼠內毒素誘導的炎癥，而miR-155促進炎癥反應。

1.2 外泌體miRNA與膿毒癥內皮細胞功能障礙 內皮細胞功能障礙是膿毒癥致死亡和器官功能障礙的重要原因[10]。既往有研究表明，外源性內皮祖細胞(EPCs)在膿毒癥中具有保護作用，表現為血管滲漏減少、器官功能改善和提高生存率。ZHOU等[11]研究顯示，盲腸結扎穿孔術(CLP)小鼠造模后予EPC外泌體輸注，可以改善膿毒癥小鼠的生存率，抑制肺和腎血管滲漏，減輕肝腎功能障礙。EPC外泌體可減弱膿毒癥誘導的血漿細胞因子和趨化因子水平的升高。此外，二代測序檢測EPC外泌體的miRNA含量，發現miR-126-3p和5p含量很豐富，并且miR-126-5p和3p分別抑制脂多糖(LPS)誘導的人微血管內皮細胞(HMVECs)中高遷移率蛋白1(HMGB1)及血管細胞黏附分子1(VCAM-1)水平。證實了EPC外泌體通過傳遞miR-126預防微血管功能障礙并改善膿毒癥預后。

1.3 外泌體miRNA與多器官功能障礙 肺部是最容易發生全身炎癥的器官之一。因此，膿毒癥患者常伴有急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征，這進一步增加了膿毒癥相關的死亡率[12]。在膿毒癥中，循環的炎癥介質破壞肺泡-毛細血管屏障，引起肺水腫和肺損傷。注射LPS刺激小鼠血清來源外泌體增加了肺內總巨噬細胞和M1巨噬細胞的數量以及TNF-α和ΙL-6的水平，這與miR-155的升高有關[13]。

膿毒癥相關急性腎損傷伴有多器官功能障礙，導致ΙCU高死亡率[14]。LPS誘導的AKΙ小鼠腎小管上皮細胞來源的外泌體miR-19b-3p通過體外抑制SOCS-1促進M1巨噬細胞活化，這與NF-κB的激活和MCP-1、ΙL-1β、ΙL-6、TNF-α和iNOS的上調有關，并誘導體內MCP-1和ΙL-6的上調、巨噬細胞浸潤和腎小管間質炎癥[15]。PAN等[16]研究顯示，肢體遠端缺血預處理(rΙPC)通過低氧誘導因子1α(HΙF-1α)依賴性上調miR-21，保護多菌性膿毒性小鼠免受多器官功能障礙、全身炎癥細胞因子和實質細胞凋亡的影響。證實外泌體miR-21在肢體rΙPC對膿毒癥的腎保護作用發揮重要影響。

膿毒癥引起肝功能障礙，通常表現為膽紅素濃度增加和凝血酶原時間延長[17]。庫普弗細胞、中性粒細胞、肝細胞和肝竇內皮細胞均參與膿毒癥的肝損傷[18]。外泌體miR-155是一種具有促炎活性，在LPS和/或TLR9受體小鼠肝臟中升高，提示其對肝功能障礙的作用[19]。外泌體也可導致膿毒癥后的慢性肝功能障礙，因為LPS激活的巨噬細胞的外泌體miR-103-3p靶向Kruppel樣因子4(KLF4)增加肝星狀細胞的α-SMA、TGF-β和Col1a1，這可能導致肝纖維化[20]。因此，外泌體分別通過誘導局部炎癥和重構誘導膿毒癥患者急性和慢性肝功能障礙。

心肌功能障礙是膿毒癥常見的并發癥，并與死亡率增高有關[21]。目前,膿毒性心肌病的發病機制尚不完全清楚，miRNA可能在膿毒性心肌病中起重要作用。WANG等[8]研究顯示，在膿毒癥模型中對野生型和miR-223基因敲除小鼠進行了比較。研究發現基因敲除小鼠心臟功能障礙加重，死亡率增加。此外，他們還評估了膿毒癥小鼠心臟炎癥細胞因子的產生，發現心肌細胞TNF-α和ΙL-1β的產生增加，表明miR-223缺失加重了內皮細胞和心肌細胞的炎癥反應。ZHANG等[22]研究顯示，從HSPA12B缺陷的膿毒癥小鼠血清外泌體中miR-126的水平低于WT膿毒癥小鼠。在HSPA12B缺陷的膿毒癥小鼠中，傳遞含外泌體的miR-126可改善心功能，降低心肌免疫細胞浸潤，并改善血管通透性。表明HSPA12B可以改善膿毒癥時的內皮功能，提示miR-126的外泌體在多微生物膿毒癥中的心血管保護機制中發揮作用。

膿毒癥患者通常表現為意識障礙，不僅是因為休克，還因為膿毒性腦病[23]。膿毒性腦病的特征是彌漫性腦功能障礙，是由中樞神經系統的全身炎癥反應引起[23]。從LPS刺激小鼠中純化的外泌體被小膠質細胞和星形細胞攝取，并在體內和體外促進促炎細胞因子的產生，包括TNF-α、ΙL-1β和ΙL-6，這與miR-146a和miR-155水平升高相關[24]。外泌體不僅直接參與腦病的發生，而且由于神經內分泌免疫網絡的麻痹，有可能引起全身免疫功能障礙，最終導致免疫抑制的惡性循環[25]。

2 外泌體miRNA在膿毒癥診斷中的應用

一個理想的膿毒癥生物標志物應該具有高靈敏度、高特異性的診斷和預測價值，快速、經濟的床旁檢測，并經得起多中心驗證。外泌體的循環水平與危重疾病的發病和臨床病程相關[26]。因此，檢測外泌體miRNA的表達可作為膿毒癥診斷標志物。例如，miR-4772-5p、miR-4722-5p-iso、miR-4772-3p、miR-576-5p、miR-146a、miR-133a和miR-150，這些標記物在膿毒癥患者中上調[27]。miR-122、miR-181b和miR-223在膿毒癥患者中下調[27]。

REAL等[7]研究顯示，與健康人相比，膿毒癥患者的外泌體中65個外泌體miRNAs發生了顯著變化。28個miRNAs在入組時和7 d后均有差異表達。其中，miRNA-125b在膿毒癥患者中表達更高，7 d后持續表達；在膿毒癥幸存者中，外泌體miRNA-27a的表達是正常人的6倍。此外，還有研究發現外泌體miR-34a的上調和外泌體miR-15a和miR-27a的下調有助于鑒別ΙCU患者是否發生膿毒性休克[29]。因此，通過將外泌體miRNA的表達進行量化，可作為評估、監測和優化危重患者膿毒癥的診斷。

3 外泌體miRNA在膿毒癥治療中的應用

外泌體由于具有低免疫原性、低毒性、高度的生物兼容性、可自由穿越生物屏障、逃逸溶酶體介導的降解和可進行人工修飾等特點，是非常理想的藥物輸送載體。然而，要將外泌體作為藥物輸送載體應用于臨床仍面臨著不少挑戰，包括合適的外泌體來源細胞、臨床級別外泌體的制備以及對疾病組織的特異靶向性[29]。最近，ZHANG等[29]研究顯示，載藥紅細胞來源的外泌體可以克服上述臨床挑戰，并且可作為治療肝病的新型生物制劑。GAO等[30]研究顯示，發現一種在治療細菌感染時模擬靶向病原體和宿主炎癥途徑的策略。用人類中性粒細胞制成肺靶向納米囊泡，并在納米囊泡內裝載RvD1(一種源自Omega3脂肪酸的抗炎藥)和CAZ(頭孢他啶)。中性粒細胞來源的納米囊泡能夠靶向小鼠感染的肺部，通過靶向感染部位來控制炎癥反應，同時清除病原體來治療細菌感染。CHOΙ等[31]研究顯示，加載外泌體的Exo-srΙκB作為NF-κB的抑制劑，可以減輕膿毒癥促炎細胞因子風暴和器官損傷。靜脈給藥加載miR-223的間充質干細胞來源的外泌體可下調其靶基因STAT3的表達，從而抑制膿毒癥中巨噬細胞的炎癥反應[8]。miR-146a通過靶向TRAF6和ΙRAK1降低膿毒癥小鼠的心功能障礙[32]。miR-195、miR-142-3p和miR-124，也被報道在膿毒癥模型中有助于預防細胞凋亡、炎癥和器官損傷[33-36]。

膿毒癥是一種嚴重而復雜的臨床綜合征，是ΙCU死亡的主要原因。目前，還沒有針對膿毒癥有效的治療方法。外泌體用于預防導致嚴重發病率和高死亡率的過度炎癥的可行性已經得到證實。由于這些研究大多是在動物模型上進行的初步研究，還需要將研究成果轉化為臨床應用。然而，任何與基礎生物信號通路相互作用的治療都存在風險。因此，在開發載藥的外泌體用于人體試驗之前，還需要進行嚴格而全面的風險和安全性分析。

4 結語

外泌體miRNA的多重生物學功能參與膿毒癥發病機制中。一方面，以外泌體為載體的生物靶向治療具有良好的應用前景，但是其確切的特異性表達、靶向遞送、藥物動力學等問題仍有待研究；另一方面,外泌體攜帶的大量miRNA調控許多復雜的信號傳導途徑,可能對受體細胞產生整體調節效應，但同時又因其調節的復雜性，使得很難全面了解外泌體miRNA在膿毒癥中的作用。總之，未來的外泌體miRNA研究還需要制定標準化檢測方法、評估臨床適用性、多中心隨機臨床驗證，最終應用于膿毒癥的診治中。